響應(yīng)面法優(yōu)化雞蛋清中蛋白質(zhì)的超聲-微波協(xié)同提取工藝

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(陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工與紡織服裝學(xué)院,陜西咸陽 712000)

雞蛋作為人們膳食中獲取蛋白質(zhì)的主要食品,深受人們的青睞。雞蛋清主要由蛋白質(zhì)和水組成,占整個(gè)蛋重的60%以上,富含多種生物活性蛋白,主要有54%卵白蛋白(ovalbumin)、13%卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(ovotransferrin)以及11%卵類黏蛋白(ovomucoid)等[1-3]構(gòu)成,這些蛋白的生物活性功能已經(jīng)得到人們?cè)絹碓綇V泛的認(rèn)可[4-7]。我國雖然是雞蛋產(chǎn)量大國,連續(xù)數(shù)年雞蛋總產(chǎn)量位居世界第一,然而,蛋品加工業(yè)發(fā)展緩慢,產(chǎn)品附加值較低[8-9]。

在蛋產(chǎn)品生產(chǎn)過程中,由于飲食習(xí)慣和食品行業(yè)的特殊需求,以蛋黃為原料生產(chǎn)卵磷脂、膽堿等已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化,蛋黃需求量較大[10],而蛋清在生產(chǎn)過程中卻被大量丟棄,造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[11]。有醫(yī)學(xué)研究者認(rèn)為雞蛋是不健康的食品,主要原因是雞蛋中膽固醇和脂肪含量較高,尤其不適合老年人食用[12]。因此,采用簡單、快速的方法有效提取雞蛋清中的活性蛋白,對(duì)充分利用我國豐富的禽蛋資源,提高蛋產(chǎn)品附加值,推動(dòng)雞蛋清中的蛋白質(zhì)在食品、醫(yī)藥及保健品當(dāng)中的應(yīng)用具有非常重要的意義[13]。

本研究以雞蛋清為原料,以蛋白質(zhì)為分離提取對(duì)象,以水為提取劑,采用超聲-微波協(xié)同提取法提取雞蛋清中的蛋白質(zhì),利用響應(yīng)曲面法(Response surface methodology,RSM)優(yōu)化提取條件,建立超聲-微波協(xié)同提取、考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量的方法,旨在為雞蛋的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)[14-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 陜西省咸陽市購物超市;無水乙醇 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA) 中國藥品生物制品檢定所;考馬斯亮藍(lán)G-250 德國達(dá)姆施塔特市默克公司。

XO-SM200微波超聲波組合反應(yīng)系統(tǒng) 南京先歐儀器制造有限公司;S-Star蛋清分離器 順財(cái)不銹鋼廚具廠;HR120精密電子天平 日本AND公司;FD-1A冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 將新鮮雞蛋打碎在干凈的燒杯里,采用蛋清分離器分離出蛋清,打發(fā)30 min致硬性發(fā)泡,將蛋清均勻涂層于載玻片表面,-40 ℃冷凍干燥12 h,最后碾磨呈粉末狀,過40目篩儲(chǔ)存?zhèn)溆肹16]。

1.2.2 超聲-微波協(xié)同提取方法 取1.2.1所述蛋清樣品粉末4.0 g,置于微波超聲波組合反應(yīng)系統(tǒng)專用玻璃反應(yīng)瓶中,加入一定體積二次去離子水,密封,連接回流裝置,按所設(shè)定的超聲和微波條件進(jìn)行提取,提取結(jié)束后,過濾,采用考馬斯亮藍(lán)法測定提取液中蛋白質(zhì)的含量,計(jì)算得率[17]。

蛋白質(zhì)得率(%)=(蛋白質(zhì)質(zhì)量/樣品粉末質(zhì)量)×100。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)1.2.2中蛋白的提取方法,分別考察不同微波功率、液料比、超聲功率和提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響。

1.2.3.1 微波功率 選擇液料比為12∶1 (mL/g),超聲功率為340 W,提取時(shí)間為9 min,微波功率設(shè)置水平分別為300、400、500、600、700 W,在此條件下,考察不同微波功率對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響。

1.2.3.2 液料比 選擇微波功率為500 W,超聲功率為340 W,提取時(shí)間為9 min,液料比水平分別為4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1 (mL/g),在此條件下,考察不同液料比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響。

1.2.3.3 超聲功率 選擇微波功率為500 W,液料比為12∶1 (mL/g),提取時(shí)間為9 min,超聲功率設(shè)置水平分別為220、280、340、400、460 W,在此條件下,考察不同超聲功率對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響。

1.2.3.4 提取時(shí)間 選擇微波功率為500 W,超聲功率為340 W,液料比為12∶1 (mL/g),提取時(shí)間分別為3、6、9、12、15 min,在此條件下,考察不同提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)(BBD)實(shí)驗(yàn)原理,選擇微波功率(A)、液料比(B)、超聲功率(C)、提取時(shí)間(D)四個(gè)因素,每個(gè)因素選取高、中、低三個(gè)水平,采用四因素三水平的響應(yīng)曲面方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Design-expert 7.0.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表1 響應(yīng)曲面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 微波功率對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響 微波功率對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響如圖1所示,從圖1中可知,開始時(shí),隨著微波功率的增大,蛋白質(zhì)得率呈現(xiàn)增大的趨勢,當(dāng)微波功率增大到500 W時(shí),蛋白質(zhì)得率達(dá)到最大,之后,隨著微波功率的繼續(xù)增大,蛋白質(zhì)得率開始下降,這可能是由于微波功率過大引起蛋白質(zhì)變性[18-19],最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)得率下降,所以選擇微波功率為500 W。

圖1 微波功率對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the yield of proteins in egg white

圖2 液料比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of proteins in egg white

2.1.2 液料比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響 不同液料比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響如圖2所示,隨著液料比的增大,蛋白質(zhì)的得率逐漸增大,當(dāng)液料比增大為12∶1 mL/g時(shí),蛋白質(zhì)得率最大,之后,隨著液料比持續(xù)增大,蛋白質(zhì)得率不再增大,呈現(xiàn)略微下降趨勢。卵白蛋白含有大量的極性、親水性氨基酸,比如谷氨酸、賴氨酸、精氨酸等,這些氨基酸非常有利于蛋白質(zhì)和水分子之間形成氫鍵或者產(chǎn)生靜電相互作用[20-21],適當(dāng)增大液料比,有利于蛋白質(zhì)的提取,但是液料比過大可能會(huì)引起部分蛋白質(zhì)水解,導(dǎo)致蛋白質(zhì)得率略微下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明適宜的液料比為12∶1 (mL/g)。

2.1.3 超聲功率對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響 超聲功率對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響如圖3所示,開始時(shí),隨著超聲功率的增大,蛋白質(zhì)得率呈現(xiàn)增大的趨勢,當(dāng)超聲功率增大到340 W時(shí),蛋白質(zhì)得率達(dá)到最大,之后,隨著超聲功率的繼續(xù)增大,蛋白質(zhì)得率開始下降,這可能是由于超聲功率過大引起蛋白質(zhì)變性,最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)得率下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,適宜的超聲功率為340 W。

圖3 超聲功率對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of proteins in egg white

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響如圖4所示,提取時(shí)間為3 min時(shí),提取不完全,得率較低,隨著提取時(shí)間的延長,蛋白質(zhì)得率逐漸增大,當(dāng)提取時(shí)間延長至9 min時(shí),蛋白質(zhì)得率達(dá)到最大,9 min以后蛋白質(zhì)得率無明顯提升,因此選擇提取時(shí)間為9 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of proteins in egg white

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)曲面法(Box-Behnken,BBD)對(duì)共計(jì)27個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),蛋白質(zhì)得率如表2所示。

表2 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and observed responses

2.2.2 回歸模型方程的建立及顯著性檢驗(yàn) 利用Design-expert 7.0.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到多元二次回歸方程模型:

Y1=-360.411+0.297A+11.718B+1.231C+12.264D+7.000E-004AB+4.095E-004AC-8.333E-006AD+5.433E-006BC - 0.128BD - 7.433E-003CD-4.485E-004A2- 0.526B2- 2.053E-003C2-0.452D2,R2=0.9067。

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for quadratic regression modle

圖5 提取條件對(duì)蛋白質(zhì)得率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface plots of variable parameters on the yield of proteins

注：p值小于0.05,對(duì)應(yīng)因素對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。

對(duì)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析,結(jié)果見表3。由表3可以看出,模型的p值為0.0004,小于0.05,表明實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型方程具有顯著性;失擬項(xiàng)F值為0.61(p=0.7564>0.05),表明失擬項(xiàng)相對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著;回歸方程顯著,相關(guān)系數(shù)R2值為0.9067。因此,該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合程度良好,能較好的反映各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系,可以利用該模型分析和預(yù)測不同提取條件下蛋白的得率變化。模型的一次項(xiàng)對(duì)蛋白的得率影響均不顯著(p>0.05);微波功率和超聲功率交互項(xiàng)顯著(p<0.05),其他交互相均不顯著(p>0.05);二次項(xiàng)均顯著(p<0.05),表明各因素對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響都不是簡單的線性關(guān)系。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸方程模型可以繪制響應(yīng)曲面圖,考察擬合響應(yīng)曲面的形狀,分析微波功率、液料比、超聲功率和提取時(shí)間各因素對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響。響應(yīng)曲面圖直觀地反映了各因素及交互作用對(duì)各響應(yīng)值的影響[22-25]。

圖5(a)為微波功率和液料比對(duì)蛋白質(zhì)得率影響的響應(yīng)曲面圖,可以看出,隨著微波功率和液料比逐漸增大,曲面呈上升趨勢,當(dāng)微波功率為500 W,液料比為12∶1 (mL/g)時(shí),得率開始趨于下降。可以確定最佳水平范圍:微波功率450～550 W,液料比10.5∶1～13.5∶1 (mL/g)。

圖5(b)～5(f)分別為微波功率和超聲功率、微波功率和提取時(shí)間、超聲功率和液料比、提取時(shí)間和液料比、超聲功率和提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率影響的響應(yīng)曲面圖,隨著相應(yīng)兩個(gè)因素的增大,蛋白質(zhì)得率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,響應(yīng)曲面開口向下,在所選范圍內(nèi)存在極值,即響應(yīng)曲面最高點(diǎn),同時(shí)也是等高線最小橢圓的中心點(diǎn)?？梢源_定最佳水平范圍:微波功率450～550 W,液料比10.5∶1～13.5∶1 (mL/g),超聲功率325～375 W,提取時(shí)間7.5～10.5 min。

通過軟件分析,超聲-微波協(xié)同提取雞蛋清中蛋白質(zhì)的最佳工藝條件為:微波功率499.66 W,液料比12.20∶1 (mL/g),超聲功率349.50 W,提取時(shí)間8.96 min,該最佳工藝條件下,蛋白質(zhì)得率的預(yù)測值為55.20%?？紤]到實(shí)際操作情況,將提取工藝參數(shù)修正為微波功率500 W,液料比12.20∶1 (mL/g),超聲功率350 W,提取時(shí)間9.0 min,三次平行實(shí)驗(yàn)得到蛋白質(zhì)得率為56.21%±0.92%。

3 結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken響應(yīng)曲面優(yōu)化法對(duì)超聲-微波協(xié)同提取雞蛋清中蛋白質(zhì)的工藝進(jìn)行了優(yōu)化,主要探討了微波功率、液料比、超聲功率及提取時(shí)間等因素對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響。在所確定的工藝條件下,蛋白質(zhì)的得率為56.21%±0.92%,表明此方法對(duì)雞蛋清中蛋白質(zhì)的提取比較徹底、得率高、用時(shí)短,而且操作簡單,環(huán)保,對(duì)提升蛋產(chǎn)品附加值具有一定的參考價(jià)值。

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