兩步酶法提取裂壺藻油的工藝優(yōu)化

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(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心, 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510300; 2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 3.廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510300)

微藻是一類在陸地、海洋分布廣泛、營(yíng)養(yǎng)豐富、種類繁多的單細(xì)胞真核生物。微藻富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖以及氨基酸和多不飽和脂肪酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),是生產(chǎn)食品、藥品、高價(jià)值生物活性物質(zhì)和生物柴油的重要原料[1-3]。大多微藻油脂的基本成分與植物油成分相似,但多富含多不飽和脂肪酸[4-5],而多不飽和脂肪酸是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),具有十分重要的作用。部分微藻因可進(jìn)行高密度異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng),是工業(yè)化生產(chǎn)富含多不飽和脂肪酸的微藻油的優(yōu)質(zhì)來(lái)源[6]。裂壺藻(Schizochytrium),是一類生活在海洋中的微藻,生長(zhǎng)速度快,易于培養(yǎng),油脂含量可以達(dá)到藻干重的40%以上[7-8]。裂壺藻油脂成分簡(jiǎn)單,二十二碳六烯酸(DHA)含量較高。DHA是ω-3系長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸,是人體大腦的重要組成部分,俗稱腦黃金,能促進(jìn)嬰幼兒的腦部和視力的機(jī)能發(fā)育,有利于智力、學(xué)習(xí)和記憶能力的提高[9-10],同時(shí)DHA還可以預(yù)防代謝紊亂,提高免疫功能和生殖健康,有效抑制血栓的形成,預(yù)防心血管疾病的發(fā)生等[11-12]。

水酶法是一種新興的油脂提取方法,主要利用機(jī)械破碎油料,以水作為分解相,采用相關(guān)的酶(如蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、維生素酶等)在水相中水解油料細(xì)胞壁從而使油脂從油料中釋放出來(lái)。利用非油成分對(duì)油和水的親和力差異及油水比重不同將非油成分和油分離[13-14]。水酶法提油作用條件較溫和,且相關(guān)酶解產(chǎn)物不與提取的油脂發(fā)生反應(yīng),所得的油純度高,品質(zhì)好;操作的溫度比較低,能耗小,可以有效保護(hù)環(huán)境[15-16]。目前人們有關(guān)于水酶法提取裂壺藻油的研究,大多是利用酶法提取油脂,然后用有機(jī)溶劑對(duì)酶解液進(jìn)行萃取,裂壺藻的油脂提取率在60%左右[17],但這樣會(huì)使用存在安全隱患的有機(jī)溶劑,同時(shí)油脂的提取率并未顯著提高。本文采用組織研磨儀來(lái)破碎裂壺藻細(xì)胞,經(jīng)堿提后,用中性蛋白酶來(lái)進(jìn)行酶解,隨后調(diào)整pH,添加堿性蛋白酶來(lái)繼續(xù)酶解,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)清油得率影響較大的作用條件采用正交實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行優(yōu)化,得到提取裂壺藻油的最佳工藝。并對(duì)所得的裂壺藻油利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行了分析,為進(jìn)一步分離純化裂壺藻油中的DHA提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裂壺藻 由本實(shí)驗(yàn)室利用松花粉垂釣法對(duì)采自廣州南沙紅樹林腐爛樹葉進(jìn)行分離純化獲得,經(jīng)鑒定確定為裂壺藻,保存于本實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù)中;細(xì)菌堿性蛋白酶(580000 U/g)Protex 6L、細(xì)菌中性蛋白酶(1600 U/g)Protex 7L 杰能科(中國(guó))生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(800 U/mg)、Alcalase 2.4L(2000 IU)、胰蛋白酶(250 U/mg) 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司;檸檬酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、氯仿、正己烷、甲醇、石油醚 均為分析純,廣州華嶼欣實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

BS224S分析天平 美國(guó)Sartorius公司;HH-4快速恒溫?cái)?shù)顯水浴箱 常州澳華儀器有限公司;Wonbio-48R高通量組織研磨儀 上海萬(wàn)柏生物科技有限公司;GCMS-QP2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用儀 日本島津公司;IS126 pH計(jì) 上海儀邁儀器科技有限公司;IKA T25數(shù)顯勻漿機(jī) 德國(guó)艾卡儀器設(shè)備有限公司;TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器 日本YAMATO公司;ZQTY-70F臺(tái)式全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;Avanti J-26XP高效離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特有限公司;DZF6050真空干燥箱 上海精宏儀器有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;Alpha1-4冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 裂壺藻的培養(yǎng)及收集 將分離純化后的裂壺藻藻種以1%的接種量接入培養(yǎng)液中,培養(yǎng)液成分為:葡萄糖25 g/L,酵母提取物5 g/L,細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L,海水晶30 g/L,pH6.8。將接種后培養(yǎng)液放入全溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),搖瓶培養(yǎng)條件為:溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min,培養(yǎng)時(shí)間為96 h。搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后收集培養(yǎng)液,在8000 r/min、溫度4 ℃的條件下離心10 min,收集底部藻泥,在-20 ℃條件下預(yù)凍12 h,然后利用冷凍干燥機(jī)在-45 ℃條件下處理24 h得到裂壺藻藻粉。

1.2.2 油脂提取工藝 稱取20 g裂壺藻粉,按一定的比例加入pH為4.8、濃度為0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,利用勻漿機(jī)處理5次;將均質(zhì)后的藻液利用高通量組織研磨儀在55 Hz的條件下研磨150 s;調(diào)pH至9.5,溫度60 ℃,勻速攪拌下堿提2 h;利用檸檬酸鈉來(lái)調(diào)節(jié)體系的pH為6.5,加入一定量的中性蛋白酶,在一定溫度條件下酶解一段時(shí)間,再利用NaOH調(diào)節(jié)pH為9.5,加入一定量的堿性蛋白酶,于恒溫水浴箱中在一定溫度條件下繼續(xù)酶解一段時(shí)間;酶解完成后將酶解液于4800 r/min離心10 min后分層,取出上層游離油。將取出的游離油放入真空干燥箱中(103±2) ℃條件下處理0.5 h,冷卻后稱量,所得結(jié)果即為清油質(zhì)量(g)。

1.2.3 清油得率測(cè)定

裂壺藻樣品含油量的測(cè)定:稱量20 g裂壺藻粉,采用氯仿-甲醇法[18]測(cè)量樣品的總油脂量(g)。

1.2.4 酶種類的篩選 對(duì)中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、Alcalase 2.4 L、胰蛋白酶提取裂壺藻油進(jìn)行實(shí)驗(yàn),參照1.2.2進(jìn)行前處理和堿提,然后分別加入5%的中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和Alcalase 2.4 L,中性蛋白酶在pH6.5、溫度45 ℃,堿性蛋白酶在pH9.5、溫度60 ℃,木瓜蛋白酶在pH7、溫度50 ℃,Alcalase 2.4 L在pH8.0、溫度55 ℃,胰蛋白酶在pH8.0、溫度37 ℃的條件下酶解4 h,酶解完成后將酶解液在4800 r/min下離心10 min,收集上層清油,計(jì)算清油得率。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 考察各因素(固定水平:料液比1∶6;中性蛋白酶添加量5%、溫度45 ℃、酶解時(shí)間2 h、酶解pH6.5;堿性蛋白酶添加量10%、溫度60 ℃、酶解時(shí)間5 h、酶解pH9.5)對(duì)裂壺藻清油得率的影響,考察的因素為:料液比1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9;中性蛋白酶添加量5%、7%、9%、11%、13%;中性蛋白酶溫度40、45、50、55、60 ℃;中性蛋白酶酶解時(shí)間1、2、3、4、5 h;堿性蛋白酶添加量8%、10%、12%、14%、16%;堿性蛋白酶酶解溫度55、60、65、70、75 ℃;堿性蛋白酶酶解時(shí)間3、4、5、6、7 h。以裂壺藻清油得率作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1.2.6 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)水酶法提取裂壺藻油的工藝進(jìn)一步優(yōu)化。選取對(duì)裂壺藻清油得率影響較大的4個(gè)因素(料液比、中性蛋白酶添加量、堿性蛋白酶添加量、堿性蛋白酶酶解溫度)進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.7 裂壺藻油脂肪酸組成的分析

1.2.7.1 脂肪酸的甲酯化 取裂壺藻油500 mg,加入體積分?jǐn)?shù)為14%三氟化硼-甲醇溶液2 mL,在60 ℃水浴的條件下進(jìn)行甲酯化反應(yīng)30 min,冷卻至室溫,分別加入1 mL正己烷和蒸餾水,振蕩1 min,靜置分層后,吸取上層有機(jī)層,揮干溶劑,用正己烷定容,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后,用GC-MS進(jìn)行分析測(cè)定[19]。

1.2.7.2 脂肪酸的GC-MS分析 GC條件:DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);進(jìn)樣口溫度230 ℃;升溫程序:110 ℃保持4 min,以10 ℃/min升溫到160 ℃,保持1 min,最后以5 ℃/min升到240 ℃,保持15 min;載氣為氦氣,流量為1.52 mL/min;采用恒線速度,分流比為1∶30;進(jìn)樣量1 μL。

MS條件:離子源溫度200 ℃;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍m/z 40～550;溶劑切除時(shí)間3 min[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)做平行實(shí)驗(yàn)共三次,數(shù)值取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。表格以及單因素結(jié)果圖都用Excel 2010軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類篩選的結(jié)果和分析

不同種類酶的清油得率結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,堿性蛋白酶的清油得率最高,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的清油得率差距不大,胰蛋白酶的清油得率最低。因木瓜蛋白酶價(jià)格較高,所以綜合酶的價(jià)格和清油得率等因素選擇中性蛋白酶和堿性蛋白酶。

圖1 不同種類酶對(duì)清油得率的影響Fig.1 Effect of different enzyme on clear oil extraction ratio

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)清油得率的影響 料液比對(duì)清油得率的影響,如圖2所示。當(dāng)料液比小于1∶7 (g/mL)時(shí),清油得率隨著料液比的增大而增加,當(dāng)料液比大于1∶7 (g/mL)時(shí),清油得率開始降低。這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)牧弦罕瓤梢蕴岣哂土系某鲇吐?。料液比過(guò)低時(shí),體系的粘度大,流動(dòng)性差,酶與底物不能夠充分接觸反應(yīng);料液比過(guò)高時(shí),酶和底物都被稀釋,相互之間碰撞的幾率降低,影響清油得率[21]。因此選擇合適的料液比為1∶7 (g/mL)。

圖2 料液比對(duì)清油得率的影響Fig.2 Effect of liquid/solid ratio on clear oil extraction ratio

2.2.2 中性蛋白酶作用條件對(duì)清油得率的影響

2.2.2.1 中性蛋白酶添加量對(duì)清油得率的影響 中性蛋白酶添加量對(duì)清油得率的影響,如圖3所示。由圖3可知,當(dāng)中性蛋白酶添加量小于7%時(shí),隨著中性蛋白酶添加量的增加,清油得率不斷升高;當(dāng)超過(guò)7%后,清油得率的變化很小,因此選擇合適的中性蛋白酶的添加量為7%。

圖3 中性蛋白酶添加量對(duì)清油得率的影響Fig.3 Effect of neutral protease addition on clear oil extraction ratio

2.2.2.2 中性蛋白酶酶解溫度對(duì)清油得率的影響 中性蛋白酶酶解溫度對(duì)清油得率的影響,如圖4所示。當(dāng)溫度在40～45 ℃范圍內(nèi)逐漸升高時(shí),清油得率不斷增高;當(dāng)溫度超過(guò)45 ℃后,隨著溫度的升高,清油得率逐漸降低,這是因?yàn)槊付加凶钸m溫度,溫度偏高或者偏低都會(huì)抑制酶的活性,進(jìn)而影響清油得率。因此選擇合適的中性蛋白酶酶解溫度為45 ℃。

圖4 中性蛋白酶酶解溫度對(duì)清油得率的影響Fig.4 Effect of neutral protease enzymatic hydrolysis temperature on clear oil extraction ratio

2.2.2.3 中性蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)清油得率的影響 中性蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)清油得率的影響,如圖5所示。當(dāng)時(shí)間小于3 h時(shí),隨著時(shí)間的延長(zhǎng)清油得率不斷增高,超過(guò)3 h后,清油得率變化很小,這是因?yàn)槌跗陔S著時(shí)間的延長(zhǎng),酶解反應(yīng)逐漸完全,隨后繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間對(duì)清油得率影響較小,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),成本不斷上升,因此中性蛋白酶的最適作用時(shí)間為3 h。

圖5 中性蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)清油得率的影響Fig.5 Effect of neutral protease enzymatic hydrolysis time on clear oil extraction ratio

2.2.3 堿性蛋白酶作用條件對(duì)清油得率的影響

2.2.3.1 堿性蛋白酶添加量對(duì)清油得率的影響 從圖6中可知,隨著堿性蛋白酶添加量的增加,清油得率不斷升高,這說(shuō)明酶用量越高,底物反應(yīng)越完全,當(dāng)堿性蛋白酶添加量超過(guò)10%時(shí),由于底物濃度不變,增大堿性蛋白酶的添加量對(duì)清油得率的影響不大,因此從成本等因素考慮,堿性蛋白酶的添加量為10%。

圖6 堿性蛋白酶添加量對(duì)清油得率的影響Fig.6 Effect of alkaline protease enzymatic hydrolysis addition on clear oil extraction ratio

2.2.3.2 堿性蛋白酶酶解溫度對(duì)清油得率的影響 由圖7可知,當(dāng)溫度在55～65 ℃范圍內(nèi)不斷升高時(shí),清油得率不斷增高;超過(guò)65 ℃后,清油得率有所降低。這是因?yàn)槊付加凶钸m溫度,當(dāng)?shù)陀谠摐囟葧r(shí),酶活性被抑制,清油得率會(huì)較低,當(dāng)高于該溫度時(shí),也會(huì)抑制酶的活性,溫度過(guò)高時(shí),蛋白質(zhì)變性使酶部分或全部失去活性[22]。因此選擇合適的溫度為65 ℃。

圖7 堿性蛋白酶酶解溫度對(duì)清油得率的影響Fig.7 Effect of alkaline protease enzymatic hydrolysis temperature on clear oil extraction ratio

2.2.3.3 堿性蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)清油得率的影響 由圖8可知,當(dāng)堿性蛋白酶酶解時(shí)間在3～6 h范圍內(nèi)不斷增加時(shí),清油得率不斷增高,當(dāng)堿性蛋白酶酶解時(shí)間超過(guò)6 h后清油得率沒(méi)有增高甚至還有少許的降低,這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng),酶解反應(yīng)不斷完全,已提取出來(lái)的游離態(tài)的油在攪拌以及溫度的作用下發(fā)生部分乳化現(xiàn)象[23],使清油得率略有減小。所以堿性蛋白酶的最適作用時(shí)間為6 h。

圖8 堿性蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)清油得率的影響Fig.8 Effect of alkaline protease enzymatic hydrolysis time on clear oil extraction ratio

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素的基礎(chǔ)上,選取對(duì)裂壺藻清油得率影響較大的4個(gè)因素(料液比、中性蛋白酶添加量、堿性蛋白酶添加量、堿性蛋白酶酶解溫度)進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,并對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)[24]。由分析結(jié)果可知,4個(gè)因素對(duì)裂壺藻清油得率的顯著影響順序?yàn)榱弦罕?A)>堿性蛋白酶添加量(C)>中性蛋白酶添加量(B)>堿性蛋白酶酶解溫度(D)。通過(guò)k值可以得出水酶法提取裂壺藻油的最優(yōu)工藝條件組合為A2B3C3D3,即料液比1∶7,中性蛋白酶添加量9%,堿性蛋白酶添加量12%,堿性蛋白酶酶解溫度70 ℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到的裂壺藻清油得率的平均值為90.22%,比正交實(shí)驗(yàn)所得的最高值還高0.41%,說(shuō)明所選條件可行。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Resign and results of orthogonal experiments

2.4 裂壺藻油脂肪酸組成分析

對(duì)最優(yōu)條件下提取所得的裂壺藻油脂肪酸甲酯進(jìn)行了GC-MS分析,最終所得的GC-MS圖譜如圖5所示。根據(jù)GC-MS聯(lián)用儀獲得質(zhì)譜信息經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照,分別為對(duì)色譜圖進(jìn)行面積歸一化定量了各種脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果表明裂壺藻油的DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 32.06%,不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.13%。兩步酶法提取的裂壺藻油與氯仿-甲醇法提取的裂壺藻油的脂肪酸組成進(jìn)行對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)兩步酶法提取的裂壺藻油脂肪酸組成和含量幾乎沒(méi)有變化,不飽和脂肪酸含量高,油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。

表3 樣品脂肪酸成分Table 3 Fatty acid composition of oil

圖9 裂壺藻油的GC-MS圖譜Fig.9 GC-MS map of oil from Schizochytrium sp.

3 結(jié)論

以裂壺藻藻粉作為原料,從幾種商品酶中篩選出中性蛋白酶和堿性蛋白酶作為水酶法提取裂壺藻油的適宜酶制劑。

采用正交實(shí)驗(yàn)和單因素相結(jié)合的方法對(duì)裂壺藻油的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,得到兩步酶法提取裂壺藻油的最佳工藝條件為:料液比1∶7,中性蛋白酶添加量9%,酶解溫度45 ℃,酶解pH6.5,酶解時(shí)間3 h;堿性蛋白酶添加量12%,酶解溫度70 ℃,酶解pH9.5,酶解時(shí)間6 h。在該條件下裂壺藻的清油得率為90.22%。裂壺藻清油得率高,乳化程度低,乳油產(chǎn)量低,這是因?yàn)閴A處理和酶處理均可以破乳,其中酶法破乳可以極大的提高破乳率,且油的品質(zhì)好[25-26]。

通過(guò)GC-MS分析,裂壺藻油不飽和脂肪酸含量高達(dá)44.13%,其中DHA含量為32.06%。油脂中DHA含量較高,油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。

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