自由基氧化對(duì)中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白的影響

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(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121000)

中國(guó)對(duì)蝦又稱東方對(duì)蝦,屬節(jié)肢動(dòng)物門,甲殼綱,十足目,對(duì)蝦科[1]。其肌肉發(fā)達(dá),口感鮮嫩且含有人體所需的多種營(yíng)養(yǎng)成分,具有“蝦類之冠”的美稱。中國(guó)對(duì)蝦富含人體所需優(yōu)質(zhì)的蛋白,其主要組成部分為肌原纖維蛋白。有研究表明,蝦類肌原纖維蛋白的含量高低直接影響其肉質(zhì)的口感,肌原纖維蛋白含量越高其肉質(zhì)口感越好。早在1989年,AM Pearson就曾經(jīng)報(bào)道過蝦肉中的肌原纖維蛋白可以直接影響對(duì)蝦的彈性、多汁性以及口感等[2]?？梢娂≡w維蛋白對(duì)蝦類的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、食用品質(zhì)及功能性起到重要作用。

中國(guó)對(duì)蝦含有較高的水分,且其肌肉組織較為松軟,死后容易迅速自溶并且容易發(fā)生蛋白質(zhì)氧化,導(dǎo)致對(duì)蝦在運(yùn)輸途中容易腐敗變質(zhì),貨架期縮短[3]。馬璐凱[4]等人在研究海藻糖、海藻膠及寡糖對(duì)南美白對(duì)蝦蛋白質(zhì)冷凍變性的抑制作用,防止蝦仁肌原纖維蛋白含量的下降作為其研究的主要指標(biāo)之一。李艷青[5]等人也研究了自由基氧化引起鯉魚肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的變化。Han Lu[6]等人研究了凝膠性質(zhì)是否會(huì)受到體內(nèi)肌原纖維蛋白氧化的影響,并為凝膠的加工提供相關(guān)信息和依據(jù)。因此自由基氧化中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白可為減緩蝦肉蛋白氧化提供理論依據(jù)。

本課題通過建立模擬自由基氧化體系,模擬蝦肉在貯存情況下受到自由基氧化的環(huán)境,通過測(cè)定巰基含量,二聚酪氨酸含量和羰基含量變化期望了解自由基氧化對(duì)中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白的影響規(guī)律,同時(shí)利用SDS-PAGE凝膠電泳,分析中國(guó)對(duì)蝦蛋白質(zhì),尤其是肌原纖維蛋白受到氧化后的降解情況,為中國(guó)對(duì)蝦長(zhǎng)期凍藏及運(yùn)輸,延長(zhǎng)貨架期,提供一定數(shù)據(jù)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中國(guó)對(duì)蝦 于2016年10月購(gòu)于錦州市林西路海鮮市場(chǎng),選擇鮮活,質(zhì)量接近(40±10) g的完整中國(guó)對(duì)蝦,購(gòu)買后立即放置于布滿冰塊的泡沫箱中,1 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn);Trolox、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB) 美國(guó)Sigma公司;過氧化氫(H2O2) 荊州雙雄化工科技有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 石家莊杰克化工有限公司;三氯乙酸(TCA)、尿素、丁基羥基茴香醚(BHA)等(均為分析純) 上海滬崢生物科技有限公司;彩虹180廣譜蛋白Marker、抗壞血酸鈉 北京索萊寶科技有限公司;茶多酚(食品級(jí)) 河北銀峰食品科技有限公司;三氯化鐵 天津大茂化學(xué)試劑廠。

HWS-12型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;PHS-25型臺(tái)式酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)股份有限公司;AUW220D型分析天平 日本島津公司;D-8PCS型紫外分光光度計(jì) 菲勒儀器有限公司;5424R型冷凍高速離心機(jī) Eppendorf艾本德(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司;STSRH-200型實(shí)驗(yàn)室均質(zhì)機(jī) 上海索廷機(jī)電設(shè)備有限公司;Bio-rad型電泳儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)蝦肌原纖維蛋白的提取[5]原料→去頭、殼→切碎→加入10倍體積20 mmol/L磷酸鹽緩沖液→勻漿(2 min)→離心(8500 r/min,4 ℃,20 min)→取沉淀→洗滌→取沉淀→勻漿(加入pH=7.4磷酸鹽緩沖液,4 ℃,1 min)→離心(8500 r/min,4 ℃,20 min)→肌原纖維蛋白。

1.2.2 對(duì)蝦肌原纖維蛋白的氧化 將提取出的肌原纖維蛋白分為12組,利用自由基氧化體系(10 μmol/L FeCl3、100 μmol/L抗壞血酸鈉并分別加入0、1、5和10 mmol/L過氧化氫)來模擬氧化。在25 ℃,不同濃度過氧化氫的氧化體系分別反應(yīng)1、3、5 h。加1 mmol/L 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚終止氧化反應(yīng),測(cè)定羰基含量、二聚酪氨酸含量、自由疏基含量、表面疏水性指標(biāo)，并進(jìn)行SDS-PAGE電脈[7]。

1.2.3 羰基含量的測(cè)定 參考Oliver[8]等的方法,并稍作修改。向離心管中加入1 mL樣品溶液,濃度為2 g/mL的,每管中加入1 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼,室溫下漩渦振蕩反應(yīng)1 h后,加入3 mL 20%三氯乙酸,于10000 r/min離心5 min,取沉淀部分加入1 mL乙酸乙酯∶乙醇(1∶1)混合溶液,沉淀需反復(fù)清洗三次,加3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液后,于37 ℃水浴鍋中保溫20 min,待沉淀溶解后,再將反應(yīng)液于10000 r/min離心3 min除去不溶物質(zhì),所得沉淀在370 nm處測(cè)吸光值,使用分子吸光系數(shù)22000 M-1·cm-1計(jì)算羰基含量,羰基含量表示為nmol/mg蛋白。

1.2.4 二聚酪氨酸含量的測(cè)定 參考Davies等[9]描述的方法,稍作調(diào)整:取10 mg樣品溶解在10 mL pH為6.0的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液中(含0.6 mol/L氯化鉀)。經(jīng)多次過濾除去溶液中的不溶性物質(zhì),通過雙縮脲法測(cè)定被溶解的蛋白濃度。利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定二聚酪氨酸含量,發(fā)射波長(zhǎng)為420 nm,激發(fā)波長(zhǎng)為325 nm,狹縫寬度均為10 nm。最終的二聚酪氨酸含量為所得吸光值除以蛋白濃度,即相對(duì)熒光值,單位為(arbitrary units,簡(jiǎn)寫AU)。

1.2.5 自由巰基含量的測(cè)定 蛋白質(zhì)的自由巰基基團(tuán)含量使用Ellman試劑法進(jìn)行[10]測(cè)定。方法如下:將2.5 mL反應(yīng)緩沖液(0.10 mol/L磷酸鈉,0.001 mol/L乙二胺四乙酸,pH=7.27)和50 μL 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶液充分混合后置于15 mL離心管中,分別加入250 μL不同濃度的二硫蘇糖醇(DTT)標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品并充分混合,于25 ℃下孵育15 min。置于波長(zhǎng)412 nm處檢測(cè)光吸收OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的OD值和DTT濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而計(jì)算樣品中自由巰基的濃度。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=407.14x-4.9954,R2=0.99。然后將樣品測(cè)得的吸收值代入方程可得樣品中含有的自由巰基濃度。

1.2.6 表面疏水性的測(cè)定 參考曾茂茂[11]等人的研究方法。采用ANS熒光探針法來測(cè)定肌原纖維蛋白的表面疏水性,將經(jīng)過自由基氧化體系模擬氧化后的肌原纖維蛋白溶解于pH7.0,濃度為0.01 mol/L的磷酸緩沖液中,濃度范圍為0.05～10 mg/mL。取2 mL樣品溶液,加入20 μL 8 mmol/L ANS,振蕩5 min,靜置3 min。在激發(fā)波長(zhǎng)λex=390 nm,發(fā)射波長(zhǎng)λex=470 nm的條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度做曲線,肌原纖維蛋白分子的表面疏水性(So)以曲線初始階段的斜率表示。

1.2.7 SDS-PAGE凝膠電泳 分別取經(jīng)不同濃度過氧化氫的自由基氧化體系氧化后的中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白溶液(20%)20 μL,依次上樣。本實(shí)驗(yàn)分離膠濃度為10%,濃縮膠濃度4.8%,樣品進(jìn)入分離膠前電流控制在15～20 mA;待樣品中的溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠之后,電流升到30～45 mA,電泳過程中保持電流不變。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到距前沿1～2 cm處停止,約1～2 h。后采用濃度為0.25%的考馬斯亮藍(lán)染液染色1 h,脫色2～4 h。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 本文數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0進(jìn)行方差分析,差異性顯著(p<0.05),Microcal Excel2010等軟件進(jìn)行圖表的繪制和相關(guān)數(shù)據(jù)的處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 自由基氧化體系對(duì)中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白中羰基含量的影響

蛋白質(zhì)主肽鏈斷裂形成羰基化合物,與相鄰蛋白質(zhì)分子上的氨基反應(yīng)形成希夫堿[12]。因此羰基含量的變化可以作為蛋白質(zhì)氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)[13]。

由圖1可以看出看出隨著氧化劑濃度的升高，羰基含量呈上升趨勢(shì)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不同濃度過氧化氫組之間的羰基含量變化更加明顯。其中過氧化氫濃度為10 mmol/L組,羰基含量從40.25 nmol·mg-1增加到85.30 nmol·mg-1。與Lin Chen[7]等人對(duì)于正常豬肉與變質(zhì)豬肉在氧化條件下羰基變化的研究相符。將相同氧化時(shí)間,不同過氧化氫濃度處理過的肌原纖維蛋白中羰基含量進(jìn)行兩兩對(duì)比,發(fā)現(xiàn)未添加過氧化氫組與過氧化氫組相比都有顯著差異(p<0.05)。分析原因可能是過氧化氫中的·OH使氨基酸側(cè)鏈上NH-或NH2-轉(zhuǎn)化為羰基基團(tuán)[12]。

圖1 自由基氧化體系對(duì)中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effects of free radical generating system on carbonyl contents of Chinese Penaeus myofibrillar protein注:字母不同表示同一氧化時(shí)間，不同濃度間差異顯著 (p<0.05);圖2～圖4同。

2.2 自由基氧化體系對(duì)中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白中二聚酪氨酸含量的影響

酪氨酸在活性氧存在時(shí)會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)[15],且蛋白質(zhì)氧化后,氨基酸殘基側(cè)鏈與鄰近的活性氨基酸殘基會(huì)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng),兩個(gè)酪氨酸殘基通過絡(luò)合作用而生成二聚酪氨酸[16]。

由圖2可以看出在相同氧化時(shí)間下,隨氧化劑濃度的增加,二聚酪氨酸含量也會(huì)增加。在氧化時(shí)間從1 h延長(zhǎng)到3 h時(shí),相同濃度氧化劑氧化后的蛋白中二聚酪氨酸含量呈上升趨勢(shì)。當(dāng)氧化時(shí)間從3 d增長(zhǎng)到5 h時(shí),過氧化氫濃度為10 mmol/L組中二聚酪氨酸含量從688 AU上升到697 AU,但是增加幅度遠(yuǎn)低于1～3 h時(shí)的增加幅度。且5 h組二聚酪氨酸含量與3 h組二聚酪氨酸含量相比較無顯著差異(p>0.05)。可能由于二聚酪氨酸分子內(nèi)發(fā)生重排[17]。隨著氧化劑濃度的增加以及氧化時(shí)間的延長(zhǎng)二聚酪氨酸的含量還是成增加趨勢(shì),與李艷青[18]等人研究的自由基氧化體系對(duì)于鯉魚肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響相一致。

圖2 自由基氧化體系對(duì)中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響Fig.2 Effects of radical generating system on dityrosine contents of Chinese Penaeus myofibrillar peotein

2.3 自由基氧化體系對(duì)中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白中自由巰基含量的影響

肌原纖維蛋白氧化后,空間結(jié)構(gòu)遭到破壞并使巰基暴露出來,被自由基進(jìn)攻后從而生成二硫鍵,因此蛋白中的自由巰基含量的減少可以作為蛋白氧化的一個(gè)重要指標(biāo)[5]。

由圖3可知,中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白的自由巰基含量可以隨著氧化時(shí)間延長(zhǎng)和氧化劑濃度的增高而呈顯著的降低趨勢(shì),且相同氧化時(shí)間下未添加過氧化氫組、過氧化氫濃度為1、5、10 mmol/L組兩兩相比較，均有顯著差異(p<0.05)。Dean[17]等人在蛋白質(zhì)氧化的研究中指出,自由基在氧化蛋白質(zhì)的過程中使巰基轉(zhuǎn)換成二硫鍵這一初期反應(yīng)產(chǎn)物。多肽分子之間的或多肽內(nèi)部的二硫鍵形成可能是導(dǎo)致巰基含量降低的主要原因。也可能是進(jìn)一步氧化成磺酸類或其他氧化產(chǎn)物,才導(dǎo)致巰基含量的下降。

圖3 自由基氧化體系對(duì)中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白自由巰基含量的影響Fig.3 Effects of free radical generating system on sulfhydryl groups contents of Chinese Penaeus myofibrillar protein

2.4 自由基氧化體系對(duì)中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性最主要依靠疏水作用,疏水作用在維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定與功能表達(dá)上起著十分重要的作用。由于蛋白質(zhì)具備大分子結(jié)構(gòu),因此表面疏水性比整體的總疏水性對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性產(chǎn)生更大的影響[20]。由于蛋白質(zhì)氧化可以使其中的疏水性氨基酸暴露或者包埋[21]。因此中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白表面疏水性可以反映蛋白質(zhì)經(jīng)氧化后其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變化。由圖4可知,隨著過氧化氫濃度的增加以及氧化時(shí)間的延長(zhǎng),中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白表面的疏水性均呈上升趨勢(shì)。在3 h的氧化時(shí)間下,隨過氧化氫濃度的提高,其表面疏水性分別上升63.3%、75.9%和82.1%。在相同氧化時(shí)間下，未添加過氧化氫組、過氧化氫濃度為1、5、10 mmol/L組兩兩比較均有顯著性差異(p<0.05)。

圖4 自由基氧化體系對(duì)中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.4 Effects of free radical generating system on the surface hydrophobicty of Chinese Penaeus myofibrillar protein

2.5 SDS-PAGE

圖5 自由基氧化體系中3 h氧化中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE pattern of Chinese Penaeus myofibrillar protein subjected to hydroxyl radical oxidation for 3 h注:1為Maker;2～5為過氧化氫濃度分別為0、1、5、10 mmol/L。

SDS-PAGE凝膠電泳可以反映蛋白質(zhì)經(jīng)氧化后,不同分子量蛋白的降解情況[22]。肌原纖維蛋白是組成肌肉中肌原纖維的蛋白質(zhì),其中肌球蛋白占蛋白質(zhì)總量的54%,肌動(dòng)蛋白占蛋白質(zhì)總量的20%～25%,還有原肌球蛋白、肌原蛋白和少量功能不明的調(diào)節(jié)性結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。由圖5可知,蛋白質(zhì)在經(jīng)過3 h,不同濃度的氧化劑氧化后發(fā)生了一定的變化。在相同氧化時(shí)間,隨著過氧化氫濃度的升高,均生成了17 kDa的小分子量蛋白質(zhì)條帶，說明每條泳道上肌原纖維蛋白均發(fā)生了一定的水解。在自然條件下，蝦肉中的肌原纖維蛋白在活性氧的作用下也會(huì)發(fā)生輕微的水解[17]，通過對(duì)比條帶顏色可以發(fā)現(xiàn)過氧化氫濃度1 mmol/L組、5 mmol/L組和10 mmol/L組的蛋白質(zhì)的水解情況要高于未添加過氧化氫組[23]，且隨著過氧化氫濃度的升高，17 kDa的小分子量蛋白質(zhì)條帶顏色越深，說明水解程度越明顯。說明氧化劑濃度改變可以對(duì)蝦肉中肌原纖維蛋白降解產(chǎn)生不同影響。

3 結(jié)論

中國(guó)對(duì)蝦肌原纖維蛋白經(jīng)自由基氧化體系氧化后,羰基含量、肌原纖維蛋白的表面疏水性及二聚酪氨酸含量顯著升高(p<0.05)，而自由巰基含量顯著降低(p<0.05)。通過SDS-PAGE電泳可以觀察出,經(jīng)自由基氧化的蝦肉肌原纖維蛋白明顯發(fā)生了降解,且隨氧化劑濃度的增加，會(huì)促進(jìn)肌原纖維蛋白的水解。所以抑制蝦肉蛋白質(zhì)的氧化是蝦肉制品在加工、貯藏和運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵點(diǎn),在運(yùn)輸過程中,可以減少蝦肉與氧氣的接觸,例如真空包裝可以延長(zhǎng)其貨架期并盡可能保留蝦肉的原有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

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