多肽體內(nèi)外肺癌靶向性鑒定研究

張正兵，臧林泉*

（1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006）

惡性腫瘤將是21世紀人類的“頭號殺手”，2014年世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2025年全球癌癥新發(fā)病人數(shù)將達到1900萬，而我國2015年新增癌癥病例達到429萬，占全球癌癥病例數(shù)的首位[1-2]。目前惡性腫瘤的藥物治療主要還是依靠傳統(tǒng)的細胞毒類藥物進行臨床化療，給惡性腫瘤病人帶來嚴重的不良反應(yīng)。小分子多肽具有分子量小、靶向性強、活性高、毒性弱、易于穿膜吸收等特點，在腫瘤靶向性研究領(lǐng)域特別是造影劑、腫瘤靶向性前體藥物的開發(fā)和研究中具有重要的意義[3]。近年研究較為熱門的是多肽作為靶向給藥載體的研究，特別是以整合素為受體的相關(guān)配體作為載體的研究。迄今為止，出現(xiàn)了許多以整合素為受體的抗血管生成的療法，其中包括有多肽、抗體、小分子干擾核糖核酸（siRNA）以及聯(lián)合用藥的靶向給藥等[4]。

1 材料與儀器

1.1 主要試劑和儀器

熒光倒置顯微鏡（德國Leica）；V7型快速混勻器（美國Essenscien公司）；獨立送回風凈化籠具（IVC）（蘇州市蘇杭實驗動物設(shè)備廠）；AUY120型電子天平（日本島津公司）；多肽FITC-Peptide1-10號（課題組設(shè)計，北京中科亞光多肽公司合成）；多聚甲醛（北京鼎國生物有限公司），OTC冷凍切片包埋液（北京鼎國生物有限公司），免疫組化專用載波片（廣州瑞舒生物有限公司）。

1.2 實驗動物

健康裸鼠，約4周齡左右，雌雄各半，體重在18～22 g，購置于中山大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（粵）2011-0029。

1.3 標本

人肺腺癌細胞系NCI-H1299，購自中科院上海細胞所；肺癌組織芯片，購自桂林泛譜生物技術(shù)有限公司，批號LUC1501。

2 實驗方法

2.1 FITC標記多肽在荷瘤裸鼠體內(nèi)組織分布

以尾靜脈注射方式將2mg/mL FITC標記的多肽（1-10號）注入裸鼠體內(nèi)，500 μL/只，同時以FITC作為陰性對照，10 min后乙醚麻醉裸鼠，橫隔水平切開皮膚，暴露全部胸壁，小心剪斷胸骨，避免損傷心臟和腫瘤供血血管；充分暴露心臟后，通過左心室用靜脈針穿刺入主動脈，同時在右心耳處剪開一小口，緩慢推注生理鹽水進行灌流，直至流出的血液變成淡紅色為止。換用4%多聚甲醛灌流，40%蔗糖脫水，待裸鼠肢體變硬即可，立刻取裸鼠皮下的瘤塊，OTC包埋后制備冰凍切片（10 μm），熒光倒置顯微鏡下觀察熒光強度并拍照。

2.2 FITC標記多肽的組織免疫熒光化學(xué)鑒定

取人肺癌組織芯片（LUC1501）于60℃烘箱中固定30 min，取出后按以下步驟脫蠟。脫蠟步驟如下：將組織芯片按順序浸泡于以下溶液中：二甲苯30 min、二甲苯10 min、100%乙醇10 min、90%乙醇10 min、80%乙醇10 min、70%乙醇10 min、50%乙醇10 min，在恒溫搖床上用PBS洗3次，5 min/次。抗原修復(fù)，采用晶芯微陣列芯片掃描儀對組織芯片的熒光進行掃描分析。以單獨FITC作為陰性對照，重復(fù)三次實驗，統(tǒng)計陽性率、假陽性率。

3 結(jié) 果

3.1 FITC標記多肽（1-10）在荷瘤裸鼠體內(nèi)組織分布

結(jié)果顯示，在10條備選多肽中，3號多肽和7號多肽對肺癌NCI-H1299體內(nèi)移植瘤組織具有較高的親和力和特異性，直接反應(yīng)在熒光強度上較其他條肽高。3號肽和7號肽主要濃集于裸鼠腫瘤組織中，呈明亮的綠色熒光，結(jié)果見圖1。

圖1 FITC標記多肽（1-10號）在肺癌NCI-H1299裸鼠腫瘤組織分布情況（100×）

圖2 FITC標記多肽與人肺癌組織芯片的免疫熒光鑒定，圖中紅色框內(nèi)為正常組織，藍色框內(nèi)為肺炎組織，黃色框內(nèi)為記號點，其余組織為各類型肺癌組織

3.2 FITC標記多肽的組織免疫熒光化學(xué)鑒定

實驗結(jié)果見圖2所示，芯片包括70例不同類型肺癌組織，5例正常及炎癥等組織。肺癌組織主要是肺鱗癌組織，肺腺癌組織，肺腺鱗癌組織，肺泡癌組織，乳頭狀腺癌組織，以及轉(zhuǎn)移癌組織等。本實驗中沒有出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，以熒光強度＞2倍肺炎和正常組織熒光強度為陽性，三張芯片取平均值統(tǒng)計陽性率和假陽性率，同時以單獨FITC作為陰性對照，對1-10號FITC標記多肽的靶向性情況進行統(tǒng)計。

統(tǒng)計結(jié)果顯示，1-10號多肽對肺癌診斷的陽性率分別為27.3%、28.2%、32.1%、21.4%、10.7%、18.2%、28.4%、19.3%、13.6%、12.9%，而FITC的陽性率為1.43%。結(jié)果表明，3號多肽和7號多肽的陽性率較其他條多肽高，表明3號肽和7號肽與肺癌各個組織的結(jié)合率高。3號多肽的陽性率最高，但是有20%的假陽性率，而7號多肽雖在陽性率28.4%較3號肽32.1%低，但是假陽性率為0%。實驗結(jié)果提示3號肽和7號肽均可用于后續(xù)的實驗。見表1。

表1 FITC標記多肽與人肺癌組織芯片的免疫熒光統(tǒng)計結(jié)果（n=3）

4 結(jié) 語

目前國內(nèi)外開發(fā)的以RGD為配體的靶向腫瘤血管的藥物已屢有報道，整合素配體—藥物復(fù)合物以及以整合素配體為靶向的藥物小分子探針多有研究[5-6]，例如含有RGD（Arg-Gly-Asp）序列的環(huán)狀5肽西侖吉肽，用于靶向性治療非小細胞肺癌、胰腺癌和肉瘤等實體瘤。

本實驗待篩選的多肽基于RGD肽設(shè)計而來，從組織切片實驗中發(fā)現(xiàn)3號和7號多肽在荷瘤裸鼠肺癌移植瘤組織中具有較強的熒光分布，提示待篩選多肽與整合素受體可能有較高的親和力。組織芯片鑒定結(jié)果顯示3號肽和7號肽具有較高的陽性結(jié)合率，但3號肽同時也伴有20%的假陽性率，而研究表明惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展常伴有前期炎癥的產(chǎn)生，腫瘤本身在生長的過程中隨著體積的增大，內(nèi)部腫瘤細胞血流量減少，提供的營養(yǎng)物質(zhì)不足以支撐其生長所必需的能量要求，內(nèi)部細胞出現(xiàn)化膿炎癥等現(xiàn)象，伴隨著炎癥的產(chǎn)生的，并通過特異性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進一步促進或誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[7-8]。通過體內(nèi)組織切片和體外組織芯片鑒定結(jié)果提示，3號多肽和7號多肽具有靶向性結(jié)合肺癌組織的作用，未來在靶向性抗肺癌新藥研究中具有重要的意義。

[1] 王建浩,程永江,李進晨,等.靶向多肽修飾的磁性納米粒子在腫瘤成像中的應(yīng)用[J].常州大學(xué)學(xué)報,2017,29(2):41-46.

[2] 趙 苗,趙 云,周 軍.靶向超聲造影劑在癌癥診療中的應(yīng)用前景[J].腫瘤防治研究,2017,44(5):360-364.

[3] 王淑靜,劉 歡,趙建凱,等.抗腫瘤多肽藥物的作用機制及研究進展[J].藥學(xué)研究,2016,35(12):717-720.

[4] 陳西良,任明華,倪少濱,等.整合素αvβ3與腫瘤靶向治療[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2012,4(7):1819-1821.

[5] Li X, Hou J, Wang C, et al. Synthesis and Biological Evaluation of RGD- Conjugated MEK1/2 Kinase Inhibitors for Integrin-Targeted Cancer Therapy[J]. Molecules,2013,18(11):13957-13978.

[6] Lee J, Lee TS, Ryu J, et al. RGD peptide conjugated multimodal NaGdF4:Yb3+/Er3 nanophosphors for upconversion luminescence, MR, and PET imaging of tumor angiogenesis [J]. J Nucl Med,2013,54(1):96-103.

[7] Voronov E, Carmi Y, Apte RN. The role IL-1 in tumor-mediated angiogenesis [J]. Front Physiol,2014,5:1-11.

[8] Oltulu YM, Coskunpinar E, Ozkan G, et al. Investigation of NF-κBI and NF-κBIA Gene Polymorphism in Non-Small Cell Lung Cancer[J]. Biomed Res Int,2014,2(23):530381-530286.