急性白血病中DKK3、DAPK、CDKN2A甲基化表達的研究

李志芹，盧 艷，賈國榮

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

DNA甲基化修飾異常在白血病發(fā)生過程中是一個早期、普遍現(xiàn)象，是其重要發(fā)病機制之一[1-2]。大量的研究資料表明[1-2]，在白血病患者中可發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因DNA異常甲基化而表達沉默，并且發(fā)生異常甲基化的抑癌基因種類在不同白血病類型有一定的差別。本研究檢測急性白血病的基因甲基化情況，為急性白血病的診斷及治療提供實驗室支持。

1 病例與方法

1.1 病例

自2015年1月～2016年12月在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科住院的急性白血病患者共50例，診斷標(biāo)準參照2008年WHO標(biāo)準。其中男21例，女29例，年齡18～65，中位年齡39。對照組為我院健康體檢患者的外周血標(biāo)本。本研究得到醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準，受試者均知情同意。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒：京天根生化科技有限公司，甲基化試劑盒：京智杰方遠科技有限公司，甲基化特異性PCR試劑盒：根生化科技有限公司，DNA甲基化引物合成：海生工有限公司。

1.3 標(biāo)本采集及制備

采集急性白血病患者診斷時的骨髓液5mL，用Ficol液進行細胞分離后放入-80℃冰箱中凍存。應(yīng)用DNA提取試劑盒進行DNA提取，甲基化試劑盒進行甲基化，甲基化特異性PCR試劑盒進行PCR擴增。引物為DKK3甲基化引物，序列上游：CGGTTTTTTTTCGTTTTCGGG序列下游：CAAACCGCTACATCTCCGCT，DAPK甲基化引物序列上游：GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC 序列下游：CCCTCCCAAACGCCGA，CDKN2A甲基化引物：序列上游TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3，序列下游：5-CCACCTAAATCGACCTCCGACCG-3；

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以百分數(shù)（%），例（n）表示，采用x2檢驗，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

（1）急性白血病患者骨髓液中DKK3、DAPK、CDKN2A甲基化表達：此三種基因甲基化均在急性白血病患者骨髓液中表達。而對照組中均未發(fā)現(xiàn)基因的甲基化表達。見表1。

（2）急性髓系白血病和急性淋巴細胞白血病患者均有基因甲基化的表達，急性髓系白血病的基因甲基化表達水平更高。

表1 急性白血病患者及對照組DKK3、DAPK、CDKN2A基因甲基化表達的比較

3 討 論

Dkk3作為一種抑癌基因，其失活或缺失可能促進多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移。在慢性淋巴細胞白血病及骨髓增生異常綜合征中發(fā)現(xiàn)DKK基因表達下降及甲基化異常，本研究發(fā)現(xiàn)在急性白血病患者中DKK3基因甲基化率為70%，其中急性髓系白血病表達率為76%，而急性淋巴細胞白血病表達率為44%。

細胞周期依賴性激酶抑制基因（ cyclin dependent kinase inhibitor，CDKN2A ）是一種多腫瘤抑制基因。KisatoNosaka等人的研究發(fā)現(xiàn)在急性成人T細胞白血?。ˋTL）中，CDKN2A基因甲基化率為47%，淋巴瘤型成人T細胞白血病甲基化率為73%。我們檢測到急性白血病患者CDKN2A基因甲基化率為56%，急性髓系白血病甲基化率為61%，顯示CDKN2A基因甲基化可能是急性白血病的發(fā)病機制之一。

死亡相關(guān)蛋白激酶（death—associated protein kinase 1，DAPK1）是調(diào)控細胞增殖與死亡的基因。我們檢測到急性白血病患者DAPK基因甲基化率為56%，此結(jié)果與國內(nèi)李俊華[3]等的研究結(jié)果接近。

通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，急性白血病患者DKK3，DAPK，CDKN2A基因甲基化均高表達，說明基因甲基化在急性白血病患者中高表達可能是一種普遍現(xiàn)象，基因甲基化可能會在急性白血病的診斷和療效監(jiān)測方面提供新的方法。

[1] Vanesa Martin;XabierAgirre;Antonio Jiménez-Velasco,et al Methylation status of Wnt signaling pathway genes affects the clinical outcome of Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia.[J]Cancer Science,2008(99):1865-1868.

[2] Danjie Jiang1,Qingxiao Hong1,Yusheng Shen et al The Diagnostic Value of DNA Methylation in Leukemia: ASystematic Review and Meta-Analysis[J]plos one 2014,9(5):e96822.

[3] 李俊華,詹 飛,陳 明.DAPK1基因啟動子CpG島甲基化在白血病發(fā)病機制中的研究,中華婦幼醫(yī)學(xué)雜志(電子版)2011,7(3):189-191.