糯玉米opaque2基因近等基因系的創(chuàng)制

張曉星 朱 慧 張東民 宋麗雅 張德貴 翁建峰 郝轉(zhuǎn)芳 李明順,*

?

糯玉米基因近等基因系的創(chuàng)制

張曉星1朱 慧1張東民1宋麗雅2張德貴1翁建峰1郝轉(zhuǎn)芳1李明順1,*

1中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所/ 農(nóng)業(yè)部遺傳育種重點實驗室, 北京 100081;2北京工商大學/ 北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室, 北京 100048

基因能夠提高糯玉米賴氨酸、色氨酸等必需氨基酸的含量。用2種優(yōu)質(zhì)蛋白玉米(QPM) CA339和魯2548自交系作為基因供體, 25個品質(zhì)較好的糯玉米自交系作為受體, 利用回交技術和SSR分子標記輔助選擇育種, 創(chuàng)制糯玉米近等基因系。分子標記結(jié)果表明, 不同受體以及兩種供體間都存在多態(tài)性。5套創(chuàng)制成功的近等基因系的賴氨酸含量比其輪回親本分別提高了59.0%、52.7%、48.5%、46.3%和61.9%, 分別由0.308%、0.313%、0.309%、0.341%、0.323%提高到0.489%、0.478%、0.458%、0.498%、0.522%。本研究表明, 可以利用此方法通過向不同遺傳背景的多種受體導入, 選取賴氨酸含量提高較大、透明表型的近等基因系, 提高糯玉米的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。

糯玉米;基因;基因; 近等基因系; 賴氨酸

糯玉米起源于中國, 因其口感軟糯、香甜適宜鮮食, 深受我國人民的喜愛。糯玉米的糯質(zhì)主要源于隱性基因, 如果基因發(fā)生突變[1-2], 將導致顆粒緊密結(jié)合型淀粉酶I (GBSS I)表達受到抑制, 使胚乳中直鏈淀粉合成受阻。由于糯玉米胚乳中的淀粉絕大部分為支鏈淀粉, 所以糯玉米也是飼料、醫(yī)藥、食品、釀造、紡織、造紙等行業(yè)的重要原料, 具有很高的經(jīng)濟價值[3]。但是糯玉米的營養(yǎng)價值并不完全, 賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸等必需氨基酸含量較少[4], 不能滿足人畜對賴氨酸的需求[5], 使糯玉米的推廣和應用受到了一定限制。所以在育種中提高糯玉米的賴氨酸含量, 對完善其營養(yǎng)品質(zhì)及提高其食用價值具有重要意義。

近年來, 將()突變基因?qū)肫胀ㄓ衩资翘岣哔嚢彼岷孔钣行У姆椒╗6]?；蛭挥谟衩椎?染色體的短臂[7-8], 編碼的O2蛋白屬于堿性亮氨酸拉鏈家族[9-11], 是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白, 能夠轉(zhuǎn)錄激活多個醇溶蛋白基因。經(jīng)前人研究, 由于突變導致轉(zhuǎn)錄功能受到抑制, 使醇溶蛋白合成減少, 非醇溶蛋白含量相應增加, 從而使玉米籽粒的賴氨酸含量增加[12-13]。但是由于突變體籽粒的粉質(zhì)、不透明、抗病性差等農(nóng)藝性狀, 限制了其應用和推廣[14]。國際小麥玉米改良中心(CIMMYT)的科研人員培育出了優(yōu)質(zhì)蛋白玉米(QPM), 利用胚乳修飾基因?qū)⒏哔嚢彼嵊衩椎姆圪|(zhì)胚乳改良為硬質(zhì)胚乳[15]。我國育種家也成功培育出CA335、CA339、齊205、魯2548等QPM自交系, 既提高了玉米籽粒的賴氨酸含量, 又將玉米胚乳改良為硬質(zhì)型, 籽粒產(chǎn)量接近或達到普通玉米雜交種[16]。

目前將基因?qū)肱从衩椎难芯窟€較少, 研究表明, 糯玉米中導入基因后, 籽粒賴氨酸含量會有不同程度的提高[17-18]。本研究通過供體材料CA339和魯2548, 將導入25份口感好、品質(zhì)優(yōu)良、農(nóng)藝性狀穩(wěn)定、抗病性強的糯玉米自交系, 利用SSR分子標記輔助育種技術監(jiān)控在子代中的傳遞, 創(chuàng)制糯玉米基因近等基因系, 利用提高糯玉米的賴氨酸含量, 從而提高糯玉米的營養(yǎng)品質(zhì), 為后續(xù)研究-NILs在籽粒形態(tài)、營養(yǎng)成分、O2蛋白等方面的變化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取25個口感好、品質(zhì)優(yōu)良、農(nóng)藝性狀穩(wěn)定、抗病性強的糯玉米自交系作為受體親本, 優(yōu)質(zhì)蛋白玉米CA339和魯2548作為基因的供體親本。以上材料均由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所玉米優(yōu)質(zhì)抗逆課題組提供, 詳細材料見表1。

表1 試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 田間種植與取樣 試驗材料于2008—2016年夏季種植于北京, 冬季種植于海南三亞,-NILs創(chuàng)制過程中分別種植2~5行供受體親本, 子代群體單穗播種1~2行, 行長3 m, 株距25 cm。在-NILs創(chuàng)制過程中, 子代群體只保留經(jīng)SSR分子標記選擇基因型正確且植株表型與受體親本植株表型相似的單株, 并嚴格進行雜交或自交授粉。

1.2.2-NILs創(chuàng)制流程 利用分子標記輔助選擇創(chuàng)制-NILs流程如圖1所示。以QPM自交系作為供體親本, 與25個糯玉米自交系雜交, 以受體材料作為輪回親本回交5~7代, 用SSR引物phi057、phi027選擇基因型為且表型與受體親本相似的雜合植株自交, 最后自交多代選擇基因純合且穩(wěn)定遺傳的植株, 直至成功創(chuàng)制-NILs。

圖1 o2w2-NILs創(chuàng)制流程圖

1.2.3 玉米葉片基因組DNA的提取 植株生長到6~7葉時的單株掛牌, 取1 cm2較幼嫩的葉片裝入2.0 mL離心管, 并加入2個小鋼珠, 放入液氮冷凍后用研磨機將樣品打碎成粉末狀, 采用CTAB法[19]提取葉片基因組DNA, 用滅菌ddH2O將DNA粉末溶解。使用NanoDrop 2000檢測DNA濃度, 將DNA濃度稀釋到100 ng μL–1左右。

1.2.4 SSR分子標記檢測基因型 引物phi057是由先鋒公司開發(fā)的基因內(nèi)的特異引物, 能夠區(qū)分顯性純合、雜合和隱性純合3種基因型; 引物phi027可特異性檢測基因型, 在回交過程中用引物phi027檢測子代的糯性。引物序列來自MaizeGDB數(shù)據(jù)庫, 由北京天一輝遠生物科技有限公司合成, 引物序列見表2。

PCR體系10 μL, 含1.5 μL 10×buffer、0.8 μL dNTP (25 mmol L–1)、0.3 μL引物(20 μmol L–1)、0.2 μLDNA聚合酶(2 U μL–1)、1.0 μL DNA模板和5.9 μL ddH2O。10×buffer、dNTP、DNA聚合酶購自天根生化科技(北京)有限公司。

表2 SSR引物信息

使用降落式PCR擴增引物phi057, 反應程序為94°C預變性5 min; 94°C變性30 s, 61°C退火30 s, 72°C延伸20 s, 5個循環(huán); 94°C變性30 s, 59°C退火30 s, 72°C延伸20 s, 10個循環(huán); 94°C變性30 s, 57°C退火30 s, 72°C延伸20 s, 20個循環(huán); 72°C延伸10 min, 12°C保存。引物phi027使用普通式PCR擴增, 94°C預變性3 min; 94°C變性30 s, 61°C退火30 s, 72°C延伸20 s, 35個循環(huán); 72°C延伸10 min, 12°C保存。PCR儀為伯樂公司的C2000ThermalCycler。

在PCR產(chǎn)物中加入1×終濃度的loading buffer, 配置8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.5 籽粒賴氨酸含量測定 選取中97-7/、中63-2/、趙OP-6/、300父本/、中501/這5套創(chuàng)制成功的-NILs及其受體親本和供體親本CA339, 稱取成熟期干燥籽粒各100 g, 送農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心, 測定玉米籽粒賴氨酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分子標記檢測供體和受體親本遺傳多態(tài)性

利用引物phi057檢測供受體親本基因的遺傳多態(tài)性。如圖2所示, 引物phi057在25種糯玉米受體親本間可以擴增出3類不同大小的條帶, 泳道C、17、19所代表的CA339、YHN1、BZH15是一類, 泳道D、3、8、10所代表的魯2548、中145、300母本(♀)、中522是一類, 其他是一類, 多態(tài)性較好。2個供體親本CA339和魯2548為隱性純合基因型, 受體親本都為顯性純合基因型, 為保證引物phi057在基因上的共顯性以便于SSR分子標記篩選, 在創(chuàng)制-NILs時, 根據(jù)遺傳多態(tài)性檢測結(jié)果配置雜交組合, 受體親本YHN1和BZH15與魯2548雜交, 其余糯玉米受體親本與CA339雜交。

2.2 回交及自交過程中利用引物phi057篩選單株

在創(chuàng)制-NILs的回交過程中, 用引物phi057對每一單株的基因型進行檢測, 根據(jù)SSR分子標記結(jié)果篩選雜合基因型植株作為非輪回親本, 與輪回親本回交。圖3是BC5F1世代部分群體的檢測結(jié)果。從電泳結(jié)果可以看出, 泳道1、3、7、8、9、10、11、12、13、14、18、20、21、22為雜合基因型, 泳道2、4、5、6、15、16、17、19為顯性純合基因型。在田間砍除顯性純合基因型的植株, 篩選雜合基因型且表型與輪回親本相似的植株繼續(xù)回交或自交。

圖2 引物phi057檢測供體和受體親本間的遺傳多態(tài)性

C: CA339; D: 魯2548; M: DNA marker; 1~25: 25個糯玉米自交系。

C: CA339; D: Lu 2548; M: DNA marker; 1-25: 25 waxy maize inbred lines.

圖3 回交過程中引物phi057檢測糯玉米自交系BC5F1世代基因型

C: CA339; R: 輪回親本; 1~22: BC5F1世代不同單株。

C: CA339; R: Recurrent parent; 1-22: Different individuals from BC5F1family.

將BC5F1回交世代的雜合植株進行嚴格的自交授粉, 將獲得的BC5F2世代分離群體播種后, 用引物phi057對每一單株的基因型進行檢測。圖4是BC5F2世代部分群體的檢測結(jié)果?？梢钥闯? 泳道6、9、10、17、24帶型與CA339帶型一致, 是隱性純合基因型, 泳道1、2、3、4、5、7、11、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23為雜合基因型, 泳道8、12、25帶型與輪回親本帶型一致, 是顯性純合基因型。篩選基因型為且田間表型與其輪回親本相似的植株繼續(xù)自交。

2.3 o2w2-NILs基因型檢測

對19套創(chuàng)制成功的-NILs進一步用引物phi057進行SSR檢測, 其帶型與供體親本帶型一致, 即確保都是隱性純合基因型。圖5所示是已創(chuàng)制成功的-NILs部分個體引物phi057檢測結(jié)果, 試驗證明基因已成功導入性狀優(yōu)良的糯玉米自交系。用引物phi027對創(chuàng)制成功的-NILs的基因型進行檢測, 結(jié)果如圖6所示, 其帶型與受體親本帶型一致, 全部為隱性純合基因型。

圖4 自交過程中引物phi057檢測糯玉米自交系BC5F2世代基因型

C: CA339; R: 輪回親本; 1~25: BC5F2世代不同單株。

C: CA339; R: Recurrent parent; 1-25: Different individuals from BC5F2family.

圖5 引物phi057檢測BC5F3世代基因型

C: CA339; R: 輪回親本; 1~34: BC5F3世代不同單株; M: DNA marker。

C: CA339; R: Recurrent parent; 1-34: Different individuals from BC5F3family; M: DNA marker.

圖6 引物phi027檢測BC5F3世代基因型

1~26: BC5F3世代不同單株; C: CA339; R: 輪回親本。

1-26: Different individuals from BC5F3family; C: CA339; R: Recurrent parent.

2.4 o2w2-NILs及其供受體親本籽粒賴氨酸含量檢測

對中97-7/、中63-2/、趙OP-6/、300父本/、中501/這5套創(chuàng)制成功的-NILs及其受體親本和供體親本CA339的成熟期干燥籽粒賴氨酸含量檢測(圖7)表明,供體親本CA339的籽粒賴氨酸含量為0.453%, 比5個輪回親本都高, 而且5套-NILs的籽粒賴氨酸含量比其受體親本均顯著提高, 分別由0.308%、0.313%、0.309%、0.341%、0.323%提高到0.489%、0.478%、0.458%、0.498%、0.522%, 分別提高了59.0%、52.7%、48.5%、46.3%和61.9% (<0.01)。說明基因的導入使糯玉米自交系的賴氨酸含量有了較大的提高, 增加了其營養(yǎng)價值。

3 討論

玉米品質(zhì)的改良一直受到育種家的重視, 糯玉米具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值, 但是缺少賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸等必需氨基酸, 使糯玉米的應用受到了限制。遺傳學家在20世紀初在玉米中發(fā)現(xiàn)了突變基因, 能夠使玉米籽粒中賴氨酸含量提高, 但是突變體產(chǎn)量低、抗逆性差、籽粒為粉質(zhì)等農(nóng)藝性狀阻礙了其商業(yè)化生產(chǎn)。CIMMYT的科研人員利用胚乳修飾基因, 將高賴氨酸玉米的粉質(zhì)胚乳改良為硬質(zhì)胚乳, 育成優(yōu)質(zhì)蛋白玉米(QPM)[20], 促進了突變基因在玉米育種和生產(chǎn)中的應用。

我國的QPM育種工作也取得了一定的進展, 培育出CA335、CA339、齊205、魯2548等QPM自交系, 可使玉米籽粒的賴氨酸含量提高到0.4%左右。利用分子標記輔助選擇技術將糯玉米自交系轉(zhuǎn)育為優(yōu)質(zhì)蛋白糯玉米自交系, 是一種高效、快速的改良糯玉米品質(zhì)的方法。20世紀末, 先鋒公司[21]和密蘇里大學開發(fā)出基因的3對SSR特異性引物, phi057、phi112和umc1066。引物phi057是共顯性標記, 能夠區(qū)分顯性純合、雜合和隱性純合基因型, 比另2種引物的標記效果更好[22-23]。在創(chuàng)制-NILs時, 必須先檢測供體親本和受體親本之間的多態(tài)性, 如圖2所示, 必須選擇具有多態(tài)性的兩個親本進行雜交, 否則在后代進行分子標記篩選單株時無法確定基因型, 選擇正確的雜交組合是創(chuàng)制-NILs的關鍵。

本試驗中檢測了5套-NILs的籽粒中賴氨酸含量, 其供體親本都是CA339, 賴氨酸含量較其受體親本都有了較大幅度的提高, 普通糯玉米自交系的賴氨酸含量平均為0.318%,-NILs的賴氨酸含量平均為0.489%。但是在不同遺傳背景中提高的幅度不同, 最低的提高了46.3%, 最高的提高了61.9%, 這說明賴氨酸含量提高的不一致可能與其受體親本有關。

圖7 賴氨酸含量檢測結(jié)果

**表示差異達到0.01顯著水平。

** indicates significance at the 0.01 probability level.

4 結(jié)論

通過SSR分子標記監(jiān)控突變基因在子代中的傳遞, 把導入到口感好、品質(zhì)優(yōu)良、抗病性強的糯玉米自交系中, 構建玉米雙隱性-NILs, 建立了一套在糯玉米中導入的分子標記輔助育種方法。通過此方法向不同遺傳背景的多種受體導入, 選取賴氨酸含量提高較大、表型透明的-NILs, 提高了糯玉米的營養(yǎng)價值和商品價值。

[1] Briggs R W, Amano E, Smith H H. Genetic recombination with ethylmethane sulphonate inducedmutants in maize., 1965, 207: 890–891

[2] Wessler S R, Tarpley A, Purugganan M, Spell M, Okagaki R. Filler DNA is associated with spontaneous deletions in maize., 1990, 87: 8731–8735

[3] 彭澤斌, 田志國. 我國糯玉米產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展戰(zhàn)略. 玉米科學, 2004, 12(3): 116–118 Peng Z B, Tian Z G. Industrialization present status and strategies for development of waxy corn in China., 2004, 12(3): 116–118 (in Chinese with English abstract)

[4] 楊引福, 郭強, 陳婧, 鄭小亞, 藺崇明. 中國溫帶糯玉米自交系遺傳品質(zhì)性狀分析. 西北植物學報, 2009, 29: 2213–2220 Yang Y F, Guo Q, Chen J, Zheng X Y, Lin C M. Analysis of genetic and quality traits of waxy corn inbred lines in China temperate zone., 2009, 29: 2213–2220 (in Chinese with English abstract)

[5] 田清震, 李新海, 李明順, 姜偉, 張世煌. 優(yōu)質(zhì)蛋白玉米的分子標記輔助選擇. 玉米科學, 2004, 12(2): 108–110 Tian Q Z, Li X H, Li M S, Jiang W, Zhang S H. Molecular markers assisted selection to quality protein maize., 2004, 12(2): 108–110 (in Chinese with English abstract)

[6] Mertz E T, Bates L S, Nelson O E. Mutant gene that changes protein composition and increases lysine content of maize endosperm., 1964, 145: 270–280

[7] Hartings H, Maddaloni M, Lazzaroni N, Fonzo N D, Motto M, Salamini F, Thompson R. Thegene which regulates zein deposition in maize endosperm encodes a protein with structural homologies to transcriptional activators., 1989, 8: 2795–2801

[8] Maddaloni M, Fonzo N D, Hartings H, Lazzaroni N, Salamini F, Thompson R, Motto M. The sequence of the zein regulatory gene-() of., 1989, 17: 7532

[9] Schmidt R J, Burr F A, Aukerman M J, Burr B. Maize regulatory geneencodes a protein with a “l(fā)eucine-zipper” motif that binds to zein DNA., 1990, 87: 46–50

[10] Schmidt R J, Ketudat M, Aukerman M J, Hoschek G.is a transcriptional activator that recognizes a specific target site in 22-kD zein genes., 1992, 4: 689–700

[11] Schmitz D, Lohmer S, Salamini F, Thompson R D. The activation domain of the maize transcription factorresides in a single acidic region., 1997, 25: 756–763

[12] Hunter B G, Beatty M K, Singletary G W, Hamaker B R, Dilkes B P, Larkins B A, Junq R. Maize opaque endosperm mutations create extensive changes in patterns of gene expression., 2002, 14: 2591–2612

[13] Viotti A, Sala E, Marotta R, Alberi P, Balducci C, Soave C. Genes and mRNAs coding for zein polypeptides in., 1979, 102: 211–222

[14] Crow J F, Kermicle J. Oliver Nelson and quality protein maize., 2002, 160: 819–821

[15] Vasal S K. High quality protein corn. In: Hallawer A R ed. Specialty Corns. Boca Raton: CRC Press, 2001. pp 85–121

[16] 宋敏, 張世煌. 優(yōu)質(zhì)蛋白玉米(QPM)育種研究進展. 新疆農(nóng)業(yè)科學, 2007, 44(增刊3): 30–35 Song M, Zhang S H. Comprehensive report on study advance of breeding of high-quality protein maize (QPM)., 2007, 44(suppl-3): 30–35 (in Chinese)

[17] Zhang W, Yang W, Wang M, Wang W, Zeng G, Chen Z, Cai Y. Increasing lysine content of waxy maize through introgression ofandgenes using molecular assisted and biochemical development., 2013, 8: e56227

[18] 昂沃, 郝小琴, 吳子愷.基因?qū)敫黝愲[性純合體玉米早代籽粒賴氨酸含量的效應研究. 玉米科學, 2012, 20(2): 56–58 Ang W, Hao X Q, Wu Z K. Analysis ofgene effects on kernel lysine content into some early generations’ homozygote recessive maize., 2012, 20(2): 56–58 (in Chinese with English abstract)

[19] 盧振宇, 李明順, 謝傳曉, 李新海, 曲延英, 張世煌. 玉米葉片DNA快速提取方法改進研究. 玉米科學, 2008, 16(2): 50–53 Lu Z Y, Li M S, Xie C X, Li X H, Qu Y Y, Zhang S H. An improved study on rapid DNA extraction method from young leaves of maize., 2008, 16(2): 50–53 (in Chinese with English abstract)

[20] Vasal S K. The quality protein maize story., 2000, 21: 445–450

[21] Chin E C, Senior M L, Shu H, Smith J S. Maize simple repetitive DNA sequences: abundance and allele variation., 1996, 39: 866–873

[22] Chen Y, Zhou Z, Zhao G, Li X, Song L, Yan N, Weng J, Hao Z, Zhang D, Li M, Zhang S. Transposable elementinduces the differential expression ofmutant gene in two maizeNILs derived from the same inbred line., 2014, 9: e85159

[23] 趙剛, 吳子愷, 陳亮, 張德貴, 張世煌, 盧振宇, 白麗, 李明順. 幾個供體對優(yōu)質(zhì)蛋白玉米(QPM)近等基因系構建效果的比較. 玉米科學, 2010, 18(6): 11–14Zhao G, Wu Z K, Chen L, Zhang D G, Zhang S H, Lu Z Y, Bai L, Li M S. Comparison of several donor inbred lines on development of quality protein maize (QPM) near-isogenic lines., 2010, 18(6): 11–14 (in Chinese with English abstract)

Construction of Waxy MaizeNear-isogenic Lines

ZHANG Xiao-Xing1, ZHU Hui1, ZHANG Dong-Min1, SONG Li-Ya2, ZHANG De-Gui1, WENG Jian-Feng1, HAO Zhuan-Fang1, and LI Ming-Shun1,*

1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China;2Beijing Technology and Business University / Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, Beijing 100048, China

In waxy maize, thegene can increase the content of essential amino acids, such as lysine and tryptophan. Two high quality protein maize (QPM) inbred lines, CA339 and Lu 2548, were used asgene donors. Twenty-five waxy maize with advantageous traits were used as receptors. Application of backcrossing and SSR marker-assisted selection in breeding can create waxy maizenear-isogenic lines. The results of molecular marker indicated that there were polymorphisms in different receptors and between the two donors. Lysine content of five sets of successfully creatednear-isogenic lines was tested, showing that the content of lysine in-NILs was 59.0%, 52.7%, 48.5%, 46.3%, and 61.9% higher than that in their recurrent parents, which was increased from 0.308%, 0.313%, 0.309%, 0.341%, 0.323% to 0.489%, 0.478%, 0.458%, 0.498%, and 0.522%, respectively. Using this method,could be introgressed into multiple receptors with different genetic backgrounds to select near-isogenic lines with high lysine content and transparent phenotype, so as to improve nutritional and economic values of waxy maize.

Waxy maize;gene;gene; Near-isogenic lines; Lysine

10.3724/SP.J.1006.2017.01760

本研究由國家自然科學基金項目(31401390)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(CAR02-01)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31401390) and the China Agriculture Research System (CAR02-01).

李明順, E-mail: limingshun@caas.cn, Tel: 010-82108747

E-mail: zhangxiaoxing0401@163.com

2017-03-09; Accepted(接受日期): 2017-07-23; Published online(網(wǎng)絡出版日期): 2017-08-10.

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170810.1616.004.html