SNP檢測方法在動物研究中的應(yīng)用

趙 杰，游新勇，徐貞貞，陳愛亮，趙 燕，何雯菁，楊曙明

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SNP檢測方法在動物研究中的應(yīng)用

趙 杰，游新勇，徐貞貞，陳愛亮，趙 燕，何雯菁，楊曙明※

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

單核苷酸多態(tài)性（SNP）作為第三代分子標(biāo)記技術(shù)，以其數(shù)量豐富、遺傳穩(wěn)定性高、易于快速自動化檢測等優(yōu)點備受關(guān)注。該文綜述了基于不同原理的SNP分型檢測方法，包括幾種常見的測序技術(shù)、基于酶學(xué)及雜交原理的分析檢測技術(shù)和基于色譜及質(zhì)譜的相關(guān)技術(shù)。闡釋了方法的原理、分析了方法的優(yōu)缺點及適用范圍?？偨Y(jié)了目前在動物遺傳育種、親緣鑒定、動物品種及產(chǎn)品溯源等方面的應(yīng)用研究現(xiàn)狀。為下一步開發(fā)更靈敏準(zhǔn)確、簡便易行、高通量及低成本的SNP檢測方法及拓展SNP的應(yīng)用領(lǐng)域提供參考。

動物；自動檢測；產(chǎn)品溯源；單核苷酸多態(tài)性（SNP）；分型檢測方法；親緣鑒定

0 引 言

分子標(biāo)記一般指基因水平上由于DNA分子缺失、堿基及序列的改變等機制而產(chǎn)生的多態(tài)性標(biāo)記[1-2]。目前已發(fā)展到以單核苷酸多態(tài)性為代表的第三代分子標(biāo)記技術(shù)[3-4]。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要是指由于單個堿基的改變引起基因組水平上的DNA序列多態(tài)性[5]，當(dāng)上述變異在群體中所占比例不小于1%時，即為單核苷酸多態(tài)，但在cDNA中的特殊情況下也可以小于1%[6]。SNP主要由2種表現(xiàn)形式：一種稱為轉(zhuǎn)換，即一個嘌呤被另一個嘌呤所代替，或一個嘧啶被另一個嘧啶所代替；一種稱為顛換，即一個嘌呤被一個嘧啶所代替，或者一個嘧啶被一個嘌呤所代替。轉(zhuǎn)換和顛換比例大約為2:1，且多發(fā)生在T堿基和C堿基之間[7]。

1 SNP分子標(biāo)記分類及特點

1.1 SNP分子標(biāo)記的分類

根據(jù)SNP在染色體上所處的位置，分為基因編碼區(qū)的cSNPs，基因間區(qū)的iSNPs及基因周邊的pSNP。其中，由于處于外顯子內(nèi)的cSNPs相對保守，其變異率僅為周圍序列的20%。根據(jù)SNP對遺傳效應(yīng)的影響，SNP也可以分三類，包括錯義突變（missence mutation），變異導(dǎo)致翻譯時氨基酸的替換，形成的蛋白質(zhì)或多肽無活性或者功能低下；無義突變（nonsence mutation）：變異形成的多肽鏈不完整或者沒有活性；同義突變（synonymy mutation），變異不會造成蛋白質(zhì)序列和性質(zhì)的改變[8]。根據(jù)SNP是否處于蛋白編碼區(qū)分為編碼SNP和非編碼SNP[9]。

1.2 SNP分子標(biāo)記的特點

①數(shù)量多且分布廣，SNPs幾乎分布于整個基因組中。研究表明，在人類基因組中其突變率約為1/1 000，整個基因組估計可達300萬之多[10]，而在其他哺乳動物中其突變率約為1/500~1/1000[11]。在植物基因組中，其平均密度1/50~/1300[12-13]。②遺傳穩(wěn)定性高，SNPs突變率僅為10-9，相比微衛(wèi)星等多態(tài)性標(biāo)記遺傳穩(wěn)定性相對較高，結(jié)果也更可靠[14-15]。③富有代表性，若突變發(fā)生在基因編碼區(qū)時，可能會直接引起生物體的疾病及遺傳改變[16]。④易實現(xiàn)自動化分析，絕大多數(shù)SNPs屬于二等位基因，分析檢測時只需判定其“有或無”，數(shù)據(jù)分析簡單[17]。

2 SNP的檢測分析方法

目前，越來越多的簡單、快速、高效、高通量的檢測方法不斷被開發(fā)出來。根據(jù)研究對象的不同，SNP檢測方法主要可以分為針對已知SNP和針對未知SNP進行分析，不過在實際應(yīng)用過程中，兩類方法往往可以結(jié)合使用以達目的[18]。根據(jù)檢測原理的不同，SNP的分型和定量技術(shù)歸納起來大致有以下幾類：

2.1 測序法

直接測序法是最直接、最準(zhǔn)確的方法。該方法對于發(fā)現(xiàn)未知的SNP十分有效，位點檢出率可達到100%。同時該方法還可區(qū)分SNP的突變類型、突變位置[19]。

2.1.1 第一代測序技術(shù)

第一代測序中以Sanger發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法應(yīng)用最多。該方法通過設(shè)計4個相互獨立的反應(yīng)，利用同位素（32P,35S）進行標(biāo)記，雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）作為鏈終止試劑，經(jīng)過DNA聚合酶延伸獲得一系列長度不同的DNA片段，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，即可獲知目的DNA分子的堿基序列[20]。后經(jīng)過不斷發(fā)展，在標(biāo)記技術(shù)上以四色熒光染料對ddNTP進行標(biāo)記，在分離技術(shù)上采用自動化程度和靈敏度更高的毛細管電泳技術(shù)。一代測序兼具準(zhǔn)確性和讀長長的優(yōu)勢，讀長已達1kb，且堿基讀取率可達99.999%，是確定基因序列的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是，受限于測序通量低、速度慢以及成本高等缺點，僅適用于位點數(shù)量及樣本量較少的情況。

2.1.2 第二代測序技術(shù)

又稱下一代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）。這是對第一代測序技術(shù)的劃時代變革，真正意義上實現(xiàn)了高通量[21]。目前，用于SNP分型檢測的二代測序技術(shù)平臺主要有：454焦磷酸測序（pyrosequencing），Solexa測序技術(shù)和SOLiD測序技術(shù)。其基本原理均是邊合成邊測序[22]。454焦磷酸測序采用循環(huán)微陣列法，無需制膠，不需要毛細管分離，也不需要熒光染料和同位素標(biāo)記，操作簡單，定量結(jié)果準(zhǔn)確，在突變位點檢測、基因頻率及細菌和病毒分型測定方面應(yīng)用廣泛。但該方法成本高，樣品制備較難，當(dāng)存在同種堿基多聚區(qū)時會出現(xiàn)背景信號升高造成無法準(zhǔn)確判定分型的情況[23]。Solexa測序技術(shù)較與454焦磷酸測序相比更具通量和成本優(yōu)勢。但受限于讀長過短，在基因組信息已知的測定中使用頻率更高[24-25]。SOLiD測序平臺可對單拷貝基因片段進行大規(guī)模擴增和高通量并行測序[26]。該技術(shù)顯著的優(yōu)點是具有雙堿基編碼技術(shù)的誤差矯正功能，準(zhǔn)確率大于99.94%，但度長更短。

2.1.3 第三代測序技術(shù)

二代測序技術(shù)有其高通量優(yōu)勢，但是PCR擴增、熒光分析等方面制約著測序的成本和效率，且讀長短，后續(xù)的序列拼接、組裝及注釋等生物信息學(xué)的分析困難[27]。在此情況下，基于單分子讀取技術(shù)的第三代測序技術(shù)有廣闊的應(yīng)用前景。其優(yōu)點在于數(shù)據(jù)讀取速度更快，無需PCR擴增，不會帶來累積效應(yīng)，成本也得以降低。對于需要高分辨率的SNP檢測、甲基化識別、以及含有大量SNP的遺傳學(xué)領(lǐng)域基因定位等第一及第二代測序技術(shù)無法勝任的領(lǐng)域潛力巨大[28-29]。

2.2 基于酶學(xué)的檢測方法

2.2.1 內(nèi)切酶技術(shù)（endonuclease digestion）

該方法的原理基于DNA序列的微小變化，包括位點的產(chǎn)生或消失均會導(dǎo)致內(nèi)切酶酶切位點發(fā)生變化。利用限制性內(nèi)切酶處理不同個體產(chǎn)生的片段長度不同，再經(jīng)電泳分離片段，從而檢測出突變位點的情況[30]?；谠撛淼臋z測技術(shù)主要有限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機擴增多態(tài)性（RAPD）、引物入侵分析技術(shù)（invader assay）和UCAN（RNase H）等。其中RFLP和RAPD是兩種技術(shù)相對成熟，需要條件相對簡單，大多數(shù)實驗室都可應(yīng)用。不過，該方法操作較為復(fù)雜，無法進行多重反應(yīng)，通量低，僅適合于存在酶切位點的SNP情況。

2.2.2 寡核苷酸連接分析（oligo nucleotide ligation assay, OLA）

該技術(shù)也稱為連接酶檢測反應(yīng)（ligase detection reaction, LDR）。試驗首先進行目標(biāo)序列的擴增并將產(chǎn)物變性為單鏈，加入兩條3′端分別可以與一種基因型互補的特異性檢測探針，及與SNP的另一側(cè)模板完全匹配的熒光標(biāo)記探針。在DNA連接酶的作用下，當(dāng)左右兩條檢測探針與目標(biāo)片段完全互補，且探針間沒有空隙時連接反應(yīng)順利進行，否則連接反應(yīng)失敗，上機測序，實現(xiàn)對SNP位點的檢測[31]。寡核苷酸連接技術(shù)基于雜交和鏈接反應(yīng)，具有雙重保證，分型結(jié)果更準(zhǔn)確。同時該方法適用于任何多態(tài)性位點，位點檢測率高，且可以進行多重反應(yīng)。屬于中等通量的分型方法，目前在SNP與疾病相關(guān)的研究方面應(yīng)用較多。

2.2.3 等位基因特異性PCR (allele-specific PCR, AS-PCR)

又名ARMS (amplification refractory mutation system)。該方法利用Taq酶無3′→5′外切酶活性，當(dāng)引物3′末端與模板發(fā)生錯配時，Taq酶的延伸速率將會降低或停止，而正常配對的引物可以順利擴增出產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物通過電泳分離后，即可判定樣本的基因型[32-33]。該方法易于操作、成本低廉，對儀器設(shè)備要求不高，還可以與real-time PCR、毛細管電泳等技術(shù)聯(lián)用實現(xiàn)實時、高通量的檢測，目前在動植物遺傳育種及臨床疾病診斷方面應(yīng)用較多。適于已知SNP位點的分型測點，特異性的引物設(shè)計是成功的關(guān)鍵[34]。

2.3 基于雜交的檢測方法

2.3.1 動態(tài)等位基因特異雜交（dynamic allele specific hybridization, DASH）

該方法是將PCR產(chǎn)物與標(biāo)記有熒光染料的寡核苷酸探針雜交，利用存在錯配堿基的異源雙鏈變性溫度低于不含錯配堿基的同源雙鏈的特性，隨著溫度逐漸升高，異源雙鏈先于同源雙鏈到達變性溫度，雙鏈變性，熒光強度迅速減弱，基于此可判定是否存在堿基突變[35]。具有結(jié)果準(zhǔn)確、快速、通量高、自動化等優(yōu)點，但是對擴增產(chǎn)物質(zhì)量要求高，需要專門的儀器設(shè)備。

2.3.2 Taqman探針法

又稱核酸外切酶法（5′-nuclease assay），基于Taq酶具有5′端外切酶活性，利用兩條普通引物及一條包含有待檢SNP位點的等位基因特異性探針進行測定。探針5′端標(biāo)記熒光基團，3′端標(biāo)記熒光猝滅基團。延伸過程中，Taq酶將與目標(biāo)序列完全互補的探針的熒光基團切割，使熒光基團和猝滅基團得以分離產(chǎn)生熒光信號。如果探針與靶序列之間存在錯配，熒光強度將會大大降低，因此可以根據(jù)反應(yīng)液中熒光的強度來判斷突變類型[30]。該技術(shù)的突出優(yōu)點是無需分離和洗脫等后續(xù)步驟，檢測速度得以大大提升。但是需要針對不同的SNP位點設(shè)計不同的探針，探針費用較高。要保證探針的準(zhǔn)確性難度較高，無法進行多重反應(yīng)，在應(yīng)用過程中受到一定限制。

2.3.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片是一種高度集成化、微型化及自動化的SNP檢測技術(shù)。該技術(shù)將針對已知SNP位點設(shè)計的探針固定在固相載體上，將擴增后的DNA單鏈與之雜交，完全互補配對則發(fā)出強的熒光，否則熒光強度即會很弱，利用熒光顯微儀器進行掃描，獲得檢測結(jié)果[30]。該方法在基因組中實現(xiàn)了快速、高通量的SNP檢測，其應(yīng)用范圍非常廣。但是，目前商業(yè)化芯片種類有限，有的還需定制，價格昂貴。同時，芯片的雜交條件受DNA序列中GC含量影響，實際操作過程中需要注意。

2.4 其他檢測技術(shù)

2.4.1 變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatograph, DHPLC）

又稱溫控高效液相色譜法，是基于單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測和變性梯度凝膠電泳2種方法而發(fā)展起來的突變檢測技術(shù)，其分離原理類似于陰離子交換層析，帶負電荷的DNA分子與帶正電荷的分離柱相結(jié)合，通過溫度調(diào)節(jié)使DHPLC在接近DNA分子的值下運行，若經(jīng)PCR擴增后的雙鏈存在錯配堿基則更易變性，在分離柱上保留時間短，易被洗脫，從而與正常的配對雙鏈分開，色譜圖上表現(xiàn)為2個或多個色譜峰，最后根據(jù)色譜峰的峰型或數(shù)目來確定SNP的有或無[36-37]。該方法自動化程度及特異性高，還可同時設(shè)定多個溫度以增加突變堿基的檢出率。特別適于低頻率突變的檢測及大批樣本的初步篩查。該方法自動化程度高，檢測變異敏感性及特異性高，且能同時實現(xiàn)片段純化。但是，分離柱精密，對試劑及樣品均有較高要求，所需費用較高。此外，它只能檢測到位點的有無，無法確定堿基突變情況及其所在位置，因而還需進一步的測序鑒定。

2.4.2 基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）

該方法是在引物的5′端引入生物素，使變性的單鏈產(chǎn)物可共價結(jié)合于硅芯片上，在硅芯片上進行引物的退火、延伸反應(yīng)，由于突變部位與正常部位配對的堿基不同，在質(zhì)譜儀上即出現(xiàn)不同的質(zhì)譜峰[38]。一個樣本經(jīng)質(zhì)譜分析僅需幾秒鐘，且結(jié)果準(zhǔn)確，但需要對分析樣本進行純化處理后才可上機測定。目前，通過化學(xué)修飾替代了純化步驟，檢測的時間和成本均大幅度下降。

3 SNP在動物研究中的應(yīng)用

3.1 SNP在動物遺傳育種中的應(yīng)用

近年，隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種已經(jīng)成為一種新的育種方法在生產(chǎn)實際中發(fā)揮越來越重要的作用，該方法利用分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀的緊密連鎖關(guān)系，通過分子標(biāo)記的選擇間接實現(xiàn)對目標(biāo)性狀的選擇?？朔藗鹘y(tǒng)形態(tài)學(xué)標(biāo)記數(shù)目少、受環(huán)境影響較大以及抽樣誤差帶來的育種準(zhǔn)確性差的不足，且可以在育種早期實施性狀鑒定，大大縮短育種周期，降低育種成本。

3.1.1 動物遺傳圖譜構(gòu)建

SNP標(biāo)記的豐富性更有利于高密度遺傳圖譜的構(gòu)建。遺傳圖譜包含的標(biāo)記越多，分布越均勻，其精度也就越高，越有利于精準(zhǔn)定位性狀基因[39]。王光凱[40]利用Illumina OvineSNP50K芯片數(shù)據(jù)構(gòu)建了綿羊的全基因組選擇信號圖譜，發(fā)現(xiàn)多個基因家族與毛色、角型、骨骼和肌肉生長發(fā)育、繁殖、免疫和毛囊生長發(fā)育相關(guān)。刁淑琪等[41]采用豬Illumina Porcine SNP60K芯片對216個杜洛克豬進行基因型分析，結(jié)果表明，該群體不同染色體間平均連鎖不平衡程度介于0.46至0.59之間，且連鎖不平衡水平隨著標(biāo)記間距的增加而衰減，變異程度隨之減小，為杜洛克豬遺傳分析及全基因組選擇研究提供參考。Wang等[42]構(gòu)建了平均標(biāo)記間隔為0.3958 cM的大菱鲆（L.）遺傳連鎖圖譜，共發(fā)現(xiàn)220個QTLs（數(shù)量性狀定位）與不同生長期的體長和體重相關(guān)。Tsai等[43]對大西洋鮭魚（Atlantic Salmon）構(gòu)建了高密度SNP連鎖圖譜，并利用該連鎖圖譜完善了參考基因組，為鮭的基因及基因組研究提供了重要的資源。

3.1.2 標(biāo)記輔助選擇

利用SNP進行標(biāo)記輔助選擇（marker-assisted selection, MSA）較QTL定位相比，更有利于實現(xiàn)單個堿基變異與表型性狀的關(guān)聯(lián)分析，更趨于精細定位。鐘昕等[44]對包括4個黃牛品種（秦川牛、魯西牛、南陽牛和郟縣紅牛）的共計459個個體采用PCR-SSCP技術(shù)對基因第8外顯子進行SNPs多態(tài)性檢測，結(jié)果表明不同基因型在體高、腰高、體長方面存在顯著差異，可以作為黃牛標(biāo)記輔助選擇的候選基因。吳曉平[45]采用Illumina BovineSNP50（54 K）牛全基因SNP芯片，對中國荷斯坦奶牛群體的29個個體進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，檢測到59個與體型性狀顯著相關(guān)的SNP位點，并定位了多個與體型容量、體深、胸寬、蹄角度、棱角性、后肢側(cè)視、乳頭長度和大小的相關(guān)的關(guān)鍵候選基因。徐珍[46]選取豬的、、和-基因進行SNPs檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因5′端調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點上游―532bp處有一插入型SNP，且該位點與背膘厚性狀呈極顯著相關(guān)（<0.01）；同時在1，2和-3基因中也分別發(fā)現(xiàn)了與出生質(zhì)量（<0.05），背膘厚、眼肌高、眼肌寬、色值和大理石評分等顯著相關(guān)（<0.01）的位點，為重要經(jīng)濟性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供了理論依據(jù)。Sharma等[47]在-、和-基因中均發(fā)現(xiàn)了新的與印度Jamunapari山羊出生質(zhì)量相關(guān)的新SNPs位點。宋永利等[48]采用PCR-SSCP方法檢測牛孕激素受體第4、8外顯子及5′UTR的SNP多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)位于第4外顯子的突變與種公牛的射精量顯著相關(guān)，位于第8外顯子的突變對凍精活精子比率和精子密度有影響，表明牛孕激素受體SNP與精液品質(zhì)存在相關(guān)性，對選育肉用種公牛提供了理論依據(jù)。

3.2 SNP在動物親緣鑒定方面的應(yīng)用

近年來，親緣鑒定在育種實踐中對于譜系劃分具有重要作用。Heaton等[49]采用分布于牛18條常染色體及2條性染色體上的32個高度多態(tài)的SNP組合進行親緣關(guān)系判斷，在美國雜交牛群體中2個隨機個體具有相同基因型的概率為2.0×10-13，在純種安格斯牛中的概率為1.9×10-10。同時，該組標(biāo)記對于2個群體的非父排除概率分別為99.9% 和99.4%。郭立平[50]采用MAF（最小等位基因頻率）為0.4818、期望雜合度為0.4998、多態(tài)信息含量為0.3748的包含50個SNP標(biāo)記組合，在母本基因型未知情況下，其累計排除概率為0.9989。該結(jié)果有助于錯誤譜系的糾正，準(zhǔn)確估計育種值具有重要意義。Rohrer等[51]從80個SNP位點中篩選出MAF>0.15的60個位點，用于美國純種杜洛克、漢普夏豬、蘭德瑞斯豬和約克夏豬組成的155個公豬群體，其種間身份同一性的概率為4.6×10-23，種內(nèi)其概率從4.3×10-14（漢普夏豬）到2.6×10-22（約克夏豬），同時該標(biāo)記組合也對于其他品種豬也可以進行親緣關(guān)系判定。另外，該應(yīng)用在解決民事糾紛、偵破刑事案件及保護珍惜動物種質(zhì)資源等方面也發(fā)揮越來越重要的作用。

3.3 SNP在動物品種及產(chǎn)品溯源中的應(yīng)用

動物品種及其產(chǎn)品溯源是食品整個供應(yīng)鏈中不可缺少的一部分，對于保障食品安全、保障公眾健康、增加消費者信心具有重要意義。同時，良好的溯源管理體系也有利于地方特色產(chǎn)品的保護，對于假冒產(chǎn)品查處，建立公平的競爭環(huán)境，維護市場秩序具有重要作用[52]。

3.3.1 SNP用于個體溯源鑒定

SNP用于個體溯源鑒定不但可以對活體動物進行識別，還可以對分割肉塊甚至對加工后的熟肉產(chǎn)品進行溯源判定，較傳統(tǒng)溯源技術(shù)更具準(zhǔn)確性和可靠性。由于SNP的二態(tài)性，理論上一個SNP可以區(qū)分3個動物個體，個位點組合則可區(qū)分3個個體。但是應(yīng)用于溯源鑒定的位點還需滿足以下2個條件：一是在目標(biāo)群體里具有高度的多態(tài)性，以保證其足夠的區(qū)分能力；二是數(shù)量上要足夠，以達到更準(zhǔn)確的溯源效果。因此，SNP用于溯源應(yīng)用的首要工作即是篩選得到一組有效的位點組合，并利用匹配概率（match probability）值來衡量該組合的效果，所謂匹配概率是指2個隨機個體具有相同基因型的概率，該值越小，2個隨機個體被誤判的幾率越小，表明所選SNP組合區(qū)分效果越好。

Orrù等[53]篩選了一組包含18個SNP的位點組合，用于意大利、丹麥常見的6個牛種群的528個個體進行識別。結(jié)果表明該組合對于個體的匹配概率依品種的不同，從百萬分之1.39 到 0.07。Wu等[54]采用7個多態(tài)性的SNP標(biāo)記組合對中國西北和華東地區(qū)的肉羊進行溯源驗證，其匹配概率為1.85‰。近年，中國在豬肉產(chǎn)品溯源方便的研究也有了不少報道，如吳瀟等采用SNP對上海一屠宰場的豬肉產(chǎn)品進行了溯源應(yīng)用研究，18個SNP標(biāo)記組合能有效區(qū)分100個個體。同時，隨機抽取的10個個體的組織樣品都能通過基因型比對找到對應(yīng)的個體來源[55]。

3.3.2 品種溯源鑒定

品種溯源鑒定對于名優(yōu)特產(chǎn)品的保護具有重要意義[56-57]。Negrin等[58]篩選出90個多態(tài)性的SNP位點對來自意大利、法國、西班牙、丹麥、荷蘭、瑞士和英國的24個品種的1047個牛肉樣品進行地理區(qū)域溯源。牛個體對其原國籍的正確符合率為90%。其中對于地理標(biāo)志產(chǎn)品—純高原牛肉的正確率為100%，意大利“Vitellonedell' Appennino Centrale”牛肉的正確率為97%。Dimauro等[59]利用SNPs標(biāo)記對21個不同的綿羊群體（20個意大利群體及1個斯洛文尼亞群體）的496個個體同原產(chǎn)地進行判別。分別選擇包括110和108個2組高度多態(tài)的SNPs標(biāo)記組合，它們能夠分別判定該21個綿羊群體及所屬的5個地理區(qū)域。Cheong等[60]采用90個SNP位點組合成功地將韓國本地肉牛品種Hanwoo同進口牛肉及國產(chǎn)荷斯坦牛區(qū)分開，保護了本國的牛肉產(chǎn)業(yè)和維護了消費者的知情權(quán)。

4 結(jié)論與展望

SNP分型檢測方法的不斷進步為進一步發(fā)現(xiàn)新的SNP位點、更精準(zhǔn)地確定SNP功能及不斷擴展新的應(yīng)用領(lǐng)域提供了強有力的技術(shù)支撐。未來，SNP的分型檢測方法將向更高效、更準(zhǔn)確、更靈活的方向發(fā)展。

SNP作為新一代分子標(biāo)記技術(shù)，因其數(shù)量豐富，遺傳穩(wěn)定性高，易于自動化分型等諸多優(yōu)點，引發(fā)了廣大研究者的濃厚興趣，新的高通量檢測方法也不斷被開發(fā)出來。理想的SNP分型方法應(yīng)同時具備以下優(yōu)點：1）操作簡單，可實現(xiàn)自動化；2）通量靈活，可根據(jù)需要加以選擇；3）分析速度快，數(shù)據(jù)處理容易；4）適應(yīng)性強，對樣本要求不高；5）結(jié)果可靠，費用可接受。然而，目前的檢測方法還不能完全滿足以上要求。未來，SNP的檢測分型方法應(yīng)根據(jù)適用范圍，在更擅長的領(lǐng)域做更精細的提升，如在高通量應(yīng)用領(lǐng)域，應(yīng)該更著眼于獲得數(shù)據(jù)的有效性；在中等通量的應(yīng)用領(lǐng)域，更多考慮到中小型試驗及臨床應(yīng)用需求；在現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域，應(yīng)朝著簡便、快速、便攜式方向發(fā)展。同時，生物、物理、化學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)的不斷進步，一定會為理想的檢測方法提供更多的技術(shù)革新。

隨著SNP分型檢測方法不斷取得新的突破，SNP的研究應(yīng)用領(lǐng)域也將持續(xù)向深度和廣度推進。目前，距離SNP大規(guī)模走向應(yīng)用還存在一些挑戰(zhàn)：如在遺傳育種方面，由于同一性狀往往是多個基因共同決定，所以仍需要進一步確定位點與表型間的顯著相關(guān)性，才能依據(jù)檢測的SNP位點進行表型篩選，指導(dǎo)育種實踐，從而獲得理想的經(jīng)濟性狀；在動物品種鑒定及產(chǎn)品溯源方面，由于各研究樣本群體遺傳背景不同，不同群體間位點的適用性還有待進一步考察，要想獲得理想的普適的標(biāo)記組合，還需通過不斷完善標(biāo)記的篩選策略及擴大代表性群體的數(shù)量來實現(xiàn)。不過，隨著研究的不斷深入、相關(guān)領(lǐng)域數(shù)據(jù)庫的逐步建立，SNP的研究應(yīng)用將逐步走向成熟。

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Review on application of SNP detection methods in animal research

Zhao Jie, You Xinyong, Xu Zhenzhen, Chen Ailiang, Zhao Yan, He Wenjing, Yang Shuming※

(100081,)

Single nucleotide polymorphism (SNP) is just a single base change in a DNA sequence, including transition, transversion, insertion or deletion of one base, and it is usual with an alternative of two possible nucleotides at a given position. It is also considered as the least frequent mutation in the biological genome, with the frequency of 1% or greater, and the mutation is widespread in the genome. SNP is usually bi-allelic mutation, which is liable to high-throughput automated analysis and genotyping. In addition, SNP is relative genetically stable than other mutations, such as simple sequence repeat (SSR), estimated to be between 1×10-9and 5×10-9per nucleotide per year at neutral positions in mammals. SNP is considered as the third generation of molecular marker, and it is very popular in both overseas and domestic scholars in many fields of research. In recent years, the methods for SNP quantification and genotyping are rapidly developed and so many new analytical techniques are renewed. The first type of genotyping and quantification technique is sequencing, such as Sanger sequencing, next generation sequencing and the third-generation sequencing. The sequencing technique can directly get the sequence information of the target fragment by comparing between sequences each other, and the detection rate can be reached to 100%. What’s more, the information of mutation type and location can be clear at the same time. The allele-specific enzymatic techniques and allele-specific hybridization-based techniques are the second type of genotyping and quantification techniques. These techniques utilize the characteristics of subtle difference in thermal stability between perfectly matched and one-base mismatched in the sequences to design different detective methods and adopt corresponding detectors. The types of method include endonuclease digestion technique, oligo nucleotide ligation assay technique, allele-specific PCR technique, dynamic allele specific hybridization technique, Taqman, DNA chip technique and so on. These approaches have realized the high throughput beyond doubt, however, due to the enzymatic and hybridization theories, in order to achieve good results, the optimal condition of PCR reaction and the carefully designed probes and hybridisation protocols are of great importance. Besides the above SNP genotyping and quantification techniques, the chromatography and mass spectrometry techniques are also employed in the field, such as denaturing high performance liquid chromatograph and MALDI-TOF-MS. The two methods are all ultra-high-throughput screening and high efficient SNP detection methods. But they are too expensive to be widely used by most researchers. Although each technique is not perfect, researchers can choose one or two suitable methods to solve their scientific problems. With the rapid development in SNP typing and improvement of relevant databases, SNP has been extensively employed in genetic studies, such as genetic maps construction, population genetics structural analysis, genetic association studies, breed and individual identification and product traceability. We hope that this article will provide some references for the SNP genotyping and quantification techniques towards to the more robust, flexible and low-cost for further development.

animals; automatic testing; trace analysis; single nucleotide polymorphism; genotyping and quantification techniques; parentage testing

2017-07-23

2018-01-10

北京市科技計劃課題（No. Z161100000616008）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（No. 1610072017010）

趙杰，博士生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測及評價研究。Email：zhaojie20090127@126.com

楊曙明，男，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為畜產(chǎn)品質(zhì)量和安全。Email：yangshuming@caas.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.04.037

S8; Q52

A

1002-6819(2018)-04-0299-07

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