血管內(nèi)介入方法制備非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物局部腦缺血模型的研究進(jìn)展

吳 迪，何小奪，陳 健，丁玉川(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中美神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100053)

卒中是成人致死、致殘的主要原因。近年來(lái)，已有1000多種神經(jīng)保護(hù)藥物在細(xì)胞和嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型上證實(shí)有效，但轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用中卻均以失敗告終[1]。其中重要的因素是人類(lèi)與嚙齒類(lèi)動(dòng)物存在巨大的種屬差異，而非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(nonhuman primates，NHPs)在組織結(jié)構(gòu)、免疫、生理和代謝等方面與人類(lèi)高度近似，因此美國(guó)卒中治療專(zhuān)業(yè)委員會(huì)建議，新的神經(jīng)保護(hù)藥物進(jìn)行臨床試驗(yàn)之前，在NHPs模型上進(jìn)行臨床前研究[2 - 3]。

大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery，MCA)是人類(lèi)腦缺血的多發(fā)部位，絕大多數(shù)的腦缺血模型都是針對(duì)MCA展開(kāi)的。NHPs局部腦缺血模型的建立方法可大致分為血管內(nèi)介入方法和開(kāi)顱手術(shù)方法，其中血管內(nèi)介入方法的模型制備過(guò)程與腦卒中的發(fā)病過(guò)程非常相似，因此值得特別關(guān)注[4]。按照血管再通情況，NHPs局部腦缺血模型可分為缺血再灌注和永久性缺血兩類(lèi)。本文將就血管內(nèi)介入方法制備N(xiāo)HPs局部腦缺血模型的最新進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和分析。

1 永久性腦缺血模型

永久性缺血模型是指制備局部腦缺血模型后不能或不必進(jìn)行干預(yù)，不會(huì)出現(xiàn)自發(fā)再灌注的方法。制備N(xiāo)HPs永久性缺血模型所用的栓子包括線栓、聚苯乙烯球、黏合劑等。通過(guò)微導(dǎo)管將上述栓子注射到NHPs的MCA，栓子閉塞血管區(qū)域?qū)⒊霈F(xiàn)局部腦缺血，并且即使給予溶栓藥物也不會(huì)實(shí)現(xiàn)再通[5 - 7]。該方法具有目標(biāo)血管閉塞完全，梗死灶明確等優(yōu)勢(shì)。

最初研究采用黏合劑作為栓塞物質(zhì)，通過(guò)微導(dǎo)管將黏合劑注射到NHPs的MCA區(qū)域，隨后影像學(xué)驗(yàn)證黏合劑閉塞MCA分支，磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)證實(shí)出現(xiàn)梗死灶。但是，該研究發(fā)現(xiàn)梗死灶大小(3.38～20.5 mL)差別很大，提示注射的黏合劑并未在注射部位局部閉塞血管[5]。因此，閉塞部位的不確定性導(dǎo)致模型癥狀和梗死灶的不均一性。此后研究中，Zhang等[6]采用絲線作為栓塞物質(zhì)，通過(guò)微導(dǎo)管將絲線送至MCA分支M2段的遠(yuǎn)端，他們發(fā)現(xiàn)恒河猴腦缺血模型梗死灶較小，而且模型出現(xiàn)對(duì)側(cè)神經(jīng)功能缺損的癥狀。為了更好的控制側(cè)支代償血流的作用，Tong等[7]采用絲線作為栓塞物質(zhì)，通過(guò)微導(dǎo)管將絲線送至MCA分支M3段，而后撤出微導(dǎo)管至M1段，在此置入絲線。該研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)該方法可以降低側(cè)支血流對(duì)于梗死灶的影響，梗死灶位置和大小相對(duì)恒定[7]。在永久性缺血模型中，通過(guò)微導(dǎo)管輔助，栓塞物質(zhì)能夠準(zhǔn)確閉塞MCA分支血管是制備N(xiāo)HPs腦缺血模型的關(guān)鍵。該模型的缺點(diǎn)是由于栓子不是血栓，尚不能進(jìn)行缺血性腦卒中的溶栓、取栓等治療。因此該模型可以很好的誘導(dǎo)局部腦缺血的發(fā)病過(guò)程，但是不能模擬干預(yù)過(guò)程。

另一種制備N(xiāo)HPs永久性腦缺血的血管內(nèi)介入方法是通過(guò)微導(dǎo)管注射微球。Cook等[8]研究發(fā)現(xiàn)，向食蟹猴頸內(nèi)動(dòng)脈注射10個(gè)直徑400 μm聚苯乙烯微球后，成功制備局部腦缺血模型。食蟹猴模型在基底節(jié)和內(nèi)囊區(qū)域出現(xiàn)顯著的梗死灶，出現(xiàn)顯著的對(duì)側(cè)神經(jīng)功能缺損癥狀。但是，注射10個(gè)直徑200 μm聚苯乙烯微球后僅出現(xiàn)輕微神經(jīng)功能缺損癥狀；注射10個(gè)直徑100 μm聚苯乙烯微球未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，即使增加到20個(gè)微球也未出現(xiàn)癥狀[8]。該研究提示，直徑400 μm聚苯乙烯微球可以閉塞食蟹猴MCA的主干，造成相應(yīng)區(qū)域的梗死。另一項(xiàng)研究中，Sato等[9]向食蟹猴頸內(nèi)動(dòng)脈注射直徑50 μm瓊脂糖微球后，模型并未表現(xiàn)局部腦缺血癥狀，MRI檢查顯示NHPs模型表現(xiàn)為腔隙性腦梗死。由于尚不能精確控制微球的閉塞部位，所以這類(lèi)模型的梗死部位不確定。但是，注射微球所致的局部腦梗死，可以模擬臨床缺血性腦卒中支架置入或取栓治療過(guò)程中微栓子脫落而導(dǎo)致腦梗死的病理過(guò)程。

2 缺血再灌注模型

隨著介入醫(yī)學(xué)技術(shù)和設(shè)備的快速發(fā)展，更多的研究采用可回收的介入裝置，包括微導(dǎo)管、微球囊、彈簧圈等，制備N(xiāo)HPs缺血再灌注模型。理論上置入上述裝置后可以造成局部腦缺血，撤出裝置后可以實(shí)現(xiàn)血管再通。該模型具有梗死部位、梗死時(shí)程可控、撤出介入裝置后可以實(shí)現(xiàn)再通等優(yōu)點(diǎn)，因此，多項(xiàng)研究采用這類(lèi)方法。

2.1 微導(dǎo)管方法

采用微導(dǎo)管制備N(xiāo)HPs局部腦缺血模型相對(duì)簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)。de Crespigny等[10]將微導(dǎo)管置于食蟹猴MCA的遠(yuǎn)端分支，阻斷局部血流3 h，MRI檢查顯示模型動(dòng)物出現(xiàn)梗死灶。此后，其他研究也采用該方法制備N(xiāo)HPs局部腦缺血模型[11]。但是，de Crespigny等[10]的研究?jī)H報(bào)道模型出現(xiàn)較小的梗死灶(0.3～1.9 mL)，提示微導(dǎo)管并未完全閉塞目標(biāo)血管。此后，Wu等[12]研究采用外徑更大的微導(dǎo)管(Rebar 18)制備N(xiāo)HPs局部腦缺血模型，即使采用相同的閉塞部位和時(shí)間，該研究發(fā)現(xiàn)較大的梗死體積(9.7～20.1 mL)，明顯超出閉塞血管的供血區(qū)域，提示微導(dǎo)管完全閉塞目標(biāo)血管，造成局部血流顯著變化。因此，選擇合適的微導(dǎo)管、最佳的閉塞位置成為該方法制備N(xiāo)HPs模型的關(guān)鍵。

2.2 微球囊方法

運(yùn)用血管內(nèi)神經(jīng)介入技術(shù)將球囊導(dǎo)管置入MCA后，加壓后充盈球囊可以閉塞MCA，釋放壓力后撤出球囊可以實(shí)現(xiàn)再灌注。Gao等[13]采用球囊導(dǎo)管置入的方式，短暫閉塞恒河猴MCA 2 h成功制備缺血再灌注模型，梗死灶主要位于基底節(jié)和內(nèi)囊部位，模型動(dòng)物出現(xiàn)對(duì)側(cè)肢體癱瘓癥狀。另一項(xiàng)研究采用相似的球囊導(dǎo)管，短暫閉塞狒狒MCA 3 h也成功制備缺血再灌注模型[14]。上述兩項(xiàng)研究表明，球囊導(dǎo)管可以成功制備N(xiāo)HPs缺血再灌注模型。但是，由于上述研究所用球囊導(dǎo)管直徑與NHPs MCA近端直徑接近，因此，球囊導(dǎo)管只能閉塞MCA近端或頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)遠(yuǎn)端血管，梗死灶通常較大，癥狀較重。

2.3 彈簧圈方法

運(yùn)用血管內(nèi)神經(jīng)介入技術(shù)將導(dǎo)管精確置于MCA特定位置后，釋放彈簧圈可以精準(zhǔn)閉塞MCA，解壓彈簧圈后可以實(shí)現(xiàn)局部血流再灌注。Zhang等[15]采用彈簧圈置入方法，短暫閉塞恒河猴MCA的M1段，缺血2 h后收回彈簧圈，實(shí)現(xiàn)再灌注，MRI檢查顯示梗死灶位于基底節(jié)區(qū)域，模型可以長(zhǎng)期存活。Guo等[16]采用相同的方法，短暫閉塞恒河猴M1段2 h后成功制備缺血再灌注模型。Zhao等[17]采用相同的方法，短暫閉塞恒河猴M2段2 h后也可成功制備缺血再灌注模型，與M1段閉塞模型相比，M2段模型的梗死灶較小、癥狀較輕。因此，彈簧圈方法可以精準(zhǔn)控制閉塞部位、閉塞時(shí)程，最終梗死灶大小與閉塞部位直接相關(guān)。

上述三種方法通過(guò)介入裝置的置入和撤出，成功模擬血栓形成和溶栓/取栓過(guò)程。但是，由于血管介入裝置對(duì)于局部血流和血管壁的影響，可能出現(xiàn)血管痙攣、局部血栓形成等不良反應(yīng)，影響模型制備的一致性。一項(xiàng)研究報(bào)道，采用球囊導(dǎo)管制備N(xiāo)HPs局部腦缺血模型后，雖然撤出球囊導(dǎo)管實(shí)現(xiàn)MCA的完全再通，但是病理學(xué)結(jié)果顯示，深穿支動(dòng)脈出現(xiàn)局部血栓形成[18]。采用上述方法制備的NHPs缺血再灌注模型，易于控制缺血時(shí)間和或缺血部位，可以實(shí)現(xiàn)血管再通。

3 血栓模型

缺血性腦卒中發(fā)生的主要原因是血栓形成和栓子脫落，而針對(duì)血栓進(jìn)行的化學(xué)溶栓或機(jī)械取栓是目前缺血性腦卒中的主要治療方法[19]。采用血管內(nèi)介入方法制備N(xiāo)HPs局部腦缺血的血栓模型，既可以模擬腦卒中的發(fā)病過(guò)程，也可以模擬腦卒中的治療和干預(yù)過(guò)程。因此，這種NHPs模型是與腦卒中發(fā)病、治療關(guān)系最密切，也是最具有轉(zhuǎn)化前景的動(dòng)物模型[20]。

早期NHPs血栓模型研究發(fā)現(xiàn)，由于不能精準(zhǔn)控制外源性血栓在MCA的位置，所以梗死灶位置和大小非常不一致。Kito等[21]向食蟹猴MCA注射單條10 cm長(zhǎng)的血栓后成功制備局部腦缺血模型，模型動(dòng)物在基底節(jié)、皮層等部位出現(xiàn)梗死灶，出現(xiàn)行為、意識(shí)、感覺(jué)等異常表現(xiàn)。該項(xiàng)研究雖然控制外源性血栓的負(fù)荷量，但是病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，外源性血栓并未完全在注射部位。Gauberti等[22]在結(jié)扎MCA近端和遠(yuǎn)端的基礎(chǔ)上，注射外源性凝血酶誘導(dǎo)局部血栓形成，成功制備恒河猴MCA主干血栓形成的局部腦缺血模型。但是，上述兩項(xiàng)研究均報(bào)道，注射血栓壓力增大后，外源性血栓存在破碎的風(fēng)險(xiǎn)，造成梗死部位的不確定性。Wu等[12]參照嚙齒類(lèi)動(dòng)物研究中制備白血栓的方法，改進(jìn)NHPs自體血栓制備方法，提高了恒河猴自體血栓的韌性。注射單條血栓后發(fā)現(xiàn)，血栓位于MCA的M1段或M2段，其中M2段血栓閉塞模型可以長(zhǎng)期存活，表現(xiàn)對(duì)側(cè)上肢神經(jīng)功能缺損，但是M1段血栓閉塞模型腦缺血癥狀嚴(yán)重，具有較高的死亡率[12]。

溶栓或取栓治療是急性缺血性腦卒中的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。因此，可以在NHPs血栓模型上模擬溶栓或取栓治療，評(píng)估新型溶栓藥物或設(shè)備。Qureshi等[23]報(bào)道，制備食蟹猴MCA血栓模型后，接受動(dòng)脈給予溶栓藥物(t-PA)治療的模型血管再通比例更高。但是，該研究每組僅納入4只模型動(dòng)物，因此，并未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另一項(xiàng)研究，制備食蟹猴MCA血栓模型后，經(jīng)動(dòng)脈給予尿激酶進(jìn)行溶栓治療，這樣可以降低梗死體積、改善意識(shí)狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)功能[24]。上述研究證明，NHPs血栓模型可以成功模擬缺血性腦卒中的發(fā)病和治療過(guò)程，給予溶栓治療后可以降低神經(jīng)功能缺損。

通過(guò)血管介入方法制備的NHPs血栓模型具有最接近臨床發(fā)病、治療過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)，但是血栓模型仍然存在閉塞部位不完全精準(zhǔn)、血栓自溶、血栓延伸等不確定因素，因此，尚需輔助其他方法克服上述缺點(diǎn)[4]。此外，由于NHPs的MCA直徑較小，即使血栓可以閉塞MCA，目前臨床常用的取栓支架尚不能通過(guò)NHPs的MCA。因此，制備更小的取栓支架后才能在NHPs血栓模型上進(jìn)行取栓實(shí)驗(yàn)。

4 NHPs模型制備中血流動(dòng)力學(xué)改變

MCA通常是制備N(xiāo)HPs局部腦缺血模型的目標(biāo)血管，同時(shí)MCA閉塞時(shí)間、程度也是關(guān)系模型術(shù)后存活、癥狀輕重的關(guān)鍵因素[25]。由于MCA供血區(qū)域廣泛，同時(shí)發(fā)出豆紋動(dòng)脈等穿支動(dòng)脈，因此，臨床研究發(fā)現(xiàn)，MCA主干閉塞后，患者將發(fā)生“惡性腦梗死”，預(yù)后不良[26]。制備N(xiāo)HPs局部腦缺血模型的研究通常選用青年或中年動(dòng)物，無(wú)其他基礎(chǔ)疾病，MCA主干閉塞后，如果沒(méi)有良好的側(cè)支循環(huán)，NHPs模型易于死亡。因此，制備N(xiāo)HPs永久性腦缺血模型的研究通常選擇M1段的遠(yuǎn)端或M2段作為閉塞部位，避免閉塞MCA的主干。這樣可以保障MCA主干通暢，避免出現(xiàn)“惡性腦梗死”。NHPs缺血再灌注模型也僅僅閉塞MCA主干2～3 h，之后血管再通，保障MCA主干通暢[4, 27]。其次，血管內(nèi)介入方法所用裝置以及栓子(血栓或其他栓子)，都將顯著影響局部腦血流。上述裝置以及栓子作為外源性異物，都可以觸發(fā)血小板凝集，形成新生血栓，造成模型癥狀加重[28]。因此，采用血管內(nèi)介入方法制備N(xiāo)HPs模型過(guò)程中，應(yīng)該特別關(guān)注模型局部腦血流的變化。

5 動(dòng)物倫理問(wèn)題

NHPs研究應(yīng)該嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求，達(dá)到“3R”原則。首先，所用神經(jīng)保護(hù)藥物應(yīng)經(jīng)過(guò)細(xì)胞模型、嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型的驗(yàn)證，具有明確顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[25]。其次，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，計(jì)算達(dá)到研究目標(biāo)所需的最少動(dòng)物數(shù)量[29]。最后，在局部腦缺血手術(shù)過(guò)程以及后續(xù)治療過(guò)程中，選擇最佳的麻醉方式，保障術(shù)中平穩(wěn)，使用陣痛、麻醉藥物，盡量降低模型動(dòng)物的痛苦[30 -31]。

NHPs局部腦缺血模型為基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)化和臨床研究提供了重要的研究工具，具有重要意義[32]。因此，根據(jù)不同研究的目標(biāo)和任務(wù)，建立重復(fù)性好、死亡率低且易于控制缺血時(shí)間的NHPs腦缺血模型是關(guān)鍵。

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