冠狀動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠制作的經(jīng)驗(yàn)體會(huì)*

高金環(huán) 張 紅，2 楊洪軍 唐仕歡 衛(wèi)軍營(yíng)△

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

冠心?。–HD）是全世界病死率較高的疾病之一。具有高發(fā)病率、致死率、發(fā)病快等特點(diǎn)，誘導(dǎo)受損的心肌細(xì)胞再生成為治療心肌梗死的重要臨床目標(biāo)，而標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物模型是心肌細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)研究的基礎(chǔ)［1-3］。本病屬中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”“真心痛”范疇［4-5］。其主要證型包括痰瘀互結(jié)證、氣陰兩虛證、氣虛血瘀證和氣滯血瘀證。在基礎(chǔ)研究方面，由于CHD的許多病理生理資料難以從臨床研究中獲得，其防治上的進(jìn)展有賴于基礎(chǔ)研究上的突破，因此利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型尋找有效的藥物以及心肌梗死發(fā)病機(jī)制被廣泛應(yīng)用［6-7］。而建立穩(wěn)定可靠的模型是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，常用CLM有開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支和開胸?cái)D出心臟結(jié)扎方法，其中，開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支是公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)CLM。而開胸?cái)D出心臟的方法損傷較大、要求速度快、操作難度較大、心臟在體外暴露時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)影響生存率等因素導(dǎo)致難以推廣。筆者長(zhǎng)期從事動(dòng)物心梗、腦心血管疾病模型研究，曾進(jìn)行大量開胸式冠狀動(dòng)脈左前降支動(dòng)脈結(jié)扎方法的動(dòng)物模型制備，完成課題組重大新藥專項(xiàng)、國(guó)家自然基金、青年基金等多項(xiàng)課題，手術(shù)成功率高達(dá)90%以上。本研究結(jié)合以往的參考文獻(xiàn)及筆者優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法和累積經(jīng)驗(yàn)，對(duì)CLM的制備過程進(jìn)行總結(jié)和探討，供心血管疾病研究者參考。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

嚙齒類動(dòng)物（鼠、兔等）、豬、狗、猴等均可用于CLM的制作，其中嚙齒類動(dòng)物大鼠具有廉價(jià)易于購(gòu)買、種系內(nèi)純性好、同系大鼠間遺傳差異小、與人類有相似的血管解剖特點(diǎn)、有極強(qiáng)的抗感染能力等特點(diǎn)，因此實(shí)驗(yàn)中最為常用，使用率超過90%［8］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量的選擇也是一個(gè)重要因素，目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為應(yīng)控制在250～350 g，但根據(jù)筆者長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為應(yīng)控制在270～320 g為宜，原因有三：1）體質(zhì)量低于270 g以下的大鼠對(duì)麻藥耐受較差，且術(shù)后死亡率高；2）體質(zhì)量大于320 g的大鼠，血管粗細(xì)程度差異明顯，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。3）此階段體質(zhì)量的大鼠耐受性較強(qiáng)，可減少造模后的死亡率。

2 手術(shù)器械選擇

在動(dòng)物模型制備中，選擇合適的器械顯得尤為重要。不合適的器械會(huì)影響模型成功率，導(dǎo)致生存率降低。筆者在制作模型過程中深有體會(huì)。1）直鑷：圓潤(rùn)的鑷子不容易損傷心肌，鑷子太鋒利會(huì)造成心肌損傷，因此筆者一般選擇2把圓潤(rùn)的直鑷，長(zhǎng)15 cm，直徑0.5 cm，鑷子前端帶平臺(tái)，撕心包膜使用。2）眼瞼器：眼瞼器是臨床眼科用器械，由于大鼠胸部較小使用眼瞼器大小合適，眼瞼器還可調(diào)節(jié)撐開的寬度，增加手術(shù)視野，有利于模型制作。3）帶針縫合線：帶針縫合線有角針和圓針，角針更鋒利一些，圓針更圓潤(rùn)損傷較小，后者更適合結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支動(dòng)脈，筆者實(shí)驗(yàn)常用6-0的帶圓針縫合線。4）持針器：長(zhǎng)12 cm，應(yīng)選擇重量輕而細(xì)，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支時(shí)力度容易掌控。5）紗布：將紗布卷成直徑1.5 cm，長(zhǎng)10 cm，墊在大鼠心臟下方，心臟會(huì)上移，有利于操作。 6）氣管插管：有研究［9］顯示造模時(shí)氣管插管和面罩通氣兩種不同的呼吸管理方式對(duì)于CLM的成模率和遠(yuǎn)期成活率沒有影響。但面罩通氣要求速度快、胸腔開放時(shí)間不宜過長(zhǎng)、比較適用于熟練操作者等因素制約，大部分實(shí)驗(yàn)人員還是選擇氣管插管的方法進(jìn)行造模。筆者采用臨床使用16 G的留置針，把前端尖端剪去制備成大鼠的氣管插管備用［10］。

3 麻醉藥物的選擇

CLM制作需要在全身麻醉的狀態(tài)下進(jìn)行，而全身麻醉對(duì)動(dòng)物的血液循環(huán)、呼吸、體溫、基礎(chǔ)代謝等均有較大的影響，甚至抑制呼吸導(dǎo)致死亡。因此，選擇合適的麻醉劑非常關(guān)鍵，目前國(guó)內(nèi)常用的麻醉藥物有乙醚、水合氯醛、烏拉坦和戊巴比妥類等。其中乙醚，實(shí)驗(yàn)人員難以控制其麻醉的時(shí)間和深度；水合氯醛對(duì)胃腸道和呼吸道有一定影響，造模后易造成腹脹及死亡，長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)不適合使用。筆者采用0.9%氯化鈉溶液配制1%的戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，其麻醉量容易掌控、副作用較小、清醒速度快。但需要注意幾點(diǎn)：1）戊巴比妥鈉需要避光保存。2）配置過程中要求無(wú)菌操作。3）按體質(zhì)量精確計(jì)算給藥劑量。4）避免注射皮下或腸腔，造成死亡或麻醉不成功。5）若麻醉不完全，可追加0.2～0.3 mL/只即可。

4 術(shù)前禁食時(shí)間

目前國(guó)內(nèi)大部分研究認(rèn)為造模前禁食不禁水12 h，但筆者發(fā)現(xiàn)術(shù)后大鼠進(jìn)食量少，體質(zhì)量減輕，死亡率增加。筆者在術(shù)前2 h禁食防止食管殘留食物，影響氣管插管操作及導(dǎo)致大鼠窒息術(shù)前自由飲水。保證室內(nèi)溫度23～25℃，濕度55%。

5 手術(shù)操作

CLM需要開胸操作，待大鼠進(jìn)入完全麻醉狀態(tài)后，將大鼠固定在鼠板上，碘伏消毒，將腋下1.5～2 cm備皮，備用。1）準(zhǔn)備氣管插管：將大鼠置于1個(gè)三角形的斜面上，用皮筋掛住大鼠的門齒 ，將大鼠頭部略向后仰 ，用臺(tái)燈照射大鼠的頸部，一手用鑷子將大鼠的舌頭向外牽拉，另一手用帶管芯的16 G靜脈留置針（剪去尖端）輕輕向上挑舌根，這時(shí)即可看見不斷開合的聲門 ，慢慢將插管對(duì)準(zhǔn)聲門向前探去，但不要接觸到聲門周圍組織 ，待聲門開放的時(shí)候，勻速將管送入聲門，并拔出管芯。用一根棉花絲在管口試驗(yàn)，以判斷是否在氣管中，如果不是，可將插管退出少許，不用管芯進(jìn)行2次插管，如果3次都沒有插管成功，就應(yīng)放棄這只大鼠。由于麻醉后大鼠體溫下降，插管成功后，需將大鼠身下放置電熱毯，溫度設(shè)置在36.5～37.0℃，用膠布將插管固定在大鼠上頜和頭部之間，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)（呼吸頻率80～90次/min，潮氣量4～6 mL/100 g，吸呼預(yù)設(shè)比1∶1），同時(shí)觀察胸廓起伏，呼吸支持建立成功的標(biāo)志是胸廓的起伏要與呼吸機(jī)工作頻率一致，且聲音順暢無(wú)阻塞感［11］。檢查呼吸機(jī)連接正常后，給大鼠監(jiān)測(cè)心電圖，右上、右下、左上、左下插入針形電極連接心電圖。2）模型制作：以心尖搏動(dòng)最強(qiáng)的點(diǎn)為中心 ，作一橫行切口，長(zhǎng)度前后距胸骨和脊柱各1 cm，在切口下方，鼠的身體下墊一個(gè)自制的紗布卷，依次切開皮膚，深淺筋膜，鈍性分離胸大肌和前鋸肌，顯露肋骨，于肋骨第4，5肋間打開胸腔，用眼瞼器撐開幅度至能完全暴露心臟，撕開中心位置的心包膜，此時(shí)心臟即往上翹起，用鑷子掀開左心耳，找到肺動(dòng)脈圓錐，于左心耳下1～2 mm處的位置穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，結(jié)扎深度1.5 mm，寬度3～3.5 mm，結(jié)扎時(shí)掌握好打結(jié)力度，看到大面積心肌缺血室壁跳動(dòng)明顯減弱，力度過大則會(huì)將心肌扎斷［12］。結(jié)扎即刻心肌明顯缺血，觀察心電圖顯示ST段太高約0.2 mV，提示模型成功。3）術(shù)后縫合：觀察大鼠5min，如果出現(xiàn)心律失常，可以在心臟表面滴少量的利多卡因或直接心臟按摩，多數(shù)心律失常能夠恢復(fù)。用小棉球吸出胸腔的積血，用3號(hào)線在切開肋間的中間先縫一針，再依次縫合兩端，縫合剩一針時(shí)將注射器前端連接軟管插入胸腔將空氣抽出形成負(fù)壓，恢復(fù)肺的張力［13］。觀察無(wú)異常后，縫合皮膚。4）氣管插管有報(bào)道［1］稱用硬膜外麻醉導(dǎo)管沿氣管插管送入，用注射器輕輕回吸，以清除呼吸道分泌物。如此時(shí)大鼠呼吸平穩(wěn)，即可拔出氣管插管。但筆者實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，大鼠處于麻醉狀態(tài)拔出氣管插管移除呼吸機(jī)，有些大鼠不耐受則會(huì)在清醒前死亡。筆者建議待大鼠清醒后移除呼吸機(jī)，拔出氣管插管，將大鼠舌頭拉出，用棉簽清理大鼠痰液，保持呼吸道暢通，術(shù)后肌注青霉素，預(yù)防感染。大鼠清醒后可自由活動(dòng)時(shí)放回鼠籠。

6 術(shù)后護(hù)理

CLM是一種死亡率較高的疾病，加之術(shù)后可能出現(xiàn)心律異常，因此術(shù)后護(hù)理非常重要［14-15］，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：1）避免大的噪音，如大聲說話，物品突然倒地造成的聲音等都有可能造成大鼠驚嚇?biāo)劳觥９P者在實(shí)驗(yàn)過程中曾發(fā)生東西墜落倒地導(dǎo)致心梗模型后的大鼠受到驚嚇造成死亡。因此筆者建議在術(shù)后大鼠做處理時(shí)務(wù)必輕拿輕放，避免驚嚇。2）術(shù)后大鼠在運(yùn)輸過程中一定注意輕拿輕放，避免大幅度晃動(dòng)，以免造成死亡。3）飼養(yǎng)環(huán)境，保持溫度23～25℃之間，濕度55%，保持通風(fēng)，術(shù)后需要更換新的飼養(yǎng)籠墊料避免感染，在術(shù)后飼養(yǎng)過程中定期更換，始終保持干燥。因大鼠在術(shù)后2～4 d精神狀態(tài)不佳，自由進(jìn)食進(jìn)水困難，故可將飼料放置在鼠籠內(nèi)。術(shù)后嚴(yán)密觀察記錄大鼠精神狀態(tài)，以便及時(shí)處理。

7 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，CLM是心肌缺血疾病的研究基礎(chǔ)，該模型操作可控、價(jià)格低廉、可重復(fù)性強(qiáng)，是心血管疾病研究者的首選。隨著心血管疾病研究的不斷深入，其模型制備方法隨之不斷的改進(jìn)和優(yōu)化。由于此模型對(duì)于大鼠機(jī)體損傷較大，一個(gè)環(huán)節(jié)的疏忽將可能造成大鼠死亡，模型制備的每一步都需要認(rèn)真細(xì)致，筆者在操作過程中，嚴(yán)格控制麻醉藥劑量、手術(shù)規(guī)范操作、術(shù)后及時(shí)護(hù)理等，模型成功率達(dá)到90%。本文對(duì)筆者制備CML模型的過程和經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)，以供心血管疾病研究者參考。