延長(zhǎng)溶栓時(shí)間窗在缺血性腦卒中tPA治療的臨床前研究進(jìn)展

陶依然，劉婷婷，孫芳玲，艾厚喜，郭德玉，王 文

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，北京 100053)

美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(national institutes of health，NIH)最初認(rèn)為組織型纖溶酶原激活劑(tissue type plasminogen activator, tPA)治療急性腦梗死的溶栓治療時(shí)間窗應(yīng)在3 h內(nèi)。2008年歐洲急性卒中協(xié)作研究Ⅲ(the european cooperative acute stroke study，ECASS-3)試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，tPA的有效治療時(shí)間窗可延長(zhǎng)至4.5 h[1]。如果超過(guò)tPA的治療時(shí)間窗進(jìn)行溶栓治療則會(huì)產(chǎn)生一系列的副作用，比如神經(jīng)毒性、水腫、出血性轉(zhuǎn)化等[2]。目前，出血反應(yīng)是溶栓藥普遍存在的不良反應(yīng)之一，嚴(yán)重的出血性轉(zhuǎn)化(hemorrhagic transformation，HT)可以導(dǎo)致腦卒中患者死亡率顯著增加[3]。HT是指由于腦梗死后缺血區(qū)重新恢復(fù)血流供應(yīng)引起的繼發(fā)性出血[4]。HT的機(jī)制很復(fù)雜，目前尚不明確，主要認(rèn)為與血腦屏障受損、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)降解、血管新生、高血壓、炎癥反應(yīng)等有關(guān)。tPA治療引起的HT與血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性增加及相關(guān)的微血管的破損有關(guān)[5]。血腦屏障的破壞是HT發(fā)生的基礎(chǔ)，血腦屏障包括毛細(xì)血管的基底膜和內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接。失去血流供應(yīng)時(shí)，血腦屏障完整性受損?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)的主要降解酶，與血管壁細(xì)胞外基質(zhì)的破壞和重建有密切的關(guān)系。腦缺血患者基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)表達(dá)量顯著增加，溶栓后MMP及其抑制劑比例嚴(yán)重失調(diào)，使得細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中層粘連蛋白laminin和組成BBB的緊密連接蛋白(ZO-1, occludin)等被降解，從而導(dǎo)致出血。缺血早期微血管內(nèi)皮細(xì)胞上出現(xiàn)白細(xì)胞粘附受體，微血管完整性改變，微血管生成被激活，提示血管新生參與了HT的過(guò)程[6]。同時(shí)高血壓，炎癥因子等也與HT有關(guān)。尋找具有治療時(shí)間窗長(zhǎng)、副作用小的腦卒中有效治療藥物對(duì)于腦卒中患者具有非常重要的意義。

由于擴(kuò)大tPA治療時(shí)間窗引起的HT與血腦屏障通透性增加及相關(guān)的微血管破損有關(guān)，所以可以通過(guò)藥物靶向性阻止血腦屏障破壞和促進(jìn)血管新生來(lái)減輕HT。本文主要結(jié)合HT的相關(guān)機(jī)制，探討在臨床前研究中可減輕超過(guò)tPA治療時(shí)間窗(中風(fēng)發(fā)作后4.5 h)而帶來(lái)不良反應(yīng)的藥物。其中包括保護(hù)血腦屏障的藥物(例如，米諾環(huán)素，西洛他唑，法舒地爾，坎地沙坦和內(nèi)酯)和促血管新生的藥物(如香豆素衍生物IMM-H004和粒細(xì)胞集落刺激因子)等。

1 血腦屏障保護(hù)劑

1.1 米諾環(huán)素

米諾環(huán)素是一種四環(huán)素衍生物，臨床用于治療痤瘡。研究表明米諾環(huán)素是一個(gè)很好的MMP抑制劑[7]，具有神經(jīng)保護(hù)作用。米諾環(huán)素(3 mg/kg，靜脈注射，卒中后4 h)和tPA(10 mg/kg，靜脈注射，卒中后6 h)聯(lián)合使用能減少梗死體積，并在中風(fēng)后24 h后改善腦出血情況[8]。米諾環(huán)素與tPA聯(lián)合使用不僅可以擴(kuò)大時(shí)間窗還能降低神經(jīng)功能評(píng)分，降低死亡率[9]。米諾環(huán)素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚不明確，可能與其抗炎、抗氧化和抗凋亡作用有關(guān)[10]。米諾環(huán)素通過(guò)抑制缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)，保護(hù)血腦屏障[11]，減少小膠質(zhì)細(xì)胞活化，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，減少神經(jīng)元的凋亡[12]。

1.2 西洛他唑

西洛他唑是FDA批準(zhǔn)治療間歇性跛行的藥物[13]。在小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型中[14]，再灌注后6 h給予tPA(10 mg/kg，靜脈注射)和西洛他唑(10 mg/kg，靜脈注射)聯(lián)合治療能減輕HT，將時(shí)間窗擴(kuò)大到18 h，連續(xù)7 d給藥能減輕腦水腫，降低發(fā)病率和死亡率，提高神經(jīng)功能。此外，西洛他唑能降低tPA治療延遲引起的MMP-9活性上調(diào)，抑制微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白claudin-5的減少[15]，保護(hù)血腦屏障不被破壞來(lái)減少HT的風(fēng)險(xiǎn)。在體外試驗(yàn)中，西洛他唑可以通過(guò)影響cAMP去阻止tPA引起的內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞損傷。

1.3 GM6001

GM6001是一種廣譜的MMP蛋白抑制劑，能夠與MMPs的活性位點(diǎn)結(jié)合阻止金屬基質(zhì)酶前體向金屬基質(zhì)酶轉(zhuǎn)化[16]。在大鼠MCAO造模后6 h給予GM6001(100 mg/kg，腹腔注射)和tPA(10 mg/kg，靜脈注射)聯(lián)合治療，可降低tPA引起的腦血紅蛋白含量升高，并降低HT[17]。免疫印跡結(jié)果顯示再灌注后42 h聯(lián)合治療能減少M(fèi)MP-9含量，并且降解封閉蛋白o(hù)ccludin和緊密連接蛋白ZO-1，但是對(duì)緊密連接蛋白claudin-5表達(dá)無(wú)影響[17]。單獨(dú)用GM6001治療也能明顯提高缺血再灌注大鼠的存活率并改善大鼠神經(jīng)功能。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GM6001能阻止tPA引起的內(nèi)皮細(xì)胞減少和跨內(nèi)皮電阻損壞。該藥物的其他潛在機(jī)制有待深入研究，如對(duì)腫瘤壞死因子TNF-α和腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)換酶表達(dá)的影響等[17-18]。

1.4 法舒地爾

法舒地爾是一個(gè)Rho激酶抑制劑，即細(xì)胞內(nèi)鈣離子拮抗劑，在日本作為蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生腦血管痙攣的治療藥物銷(xiāo)售[19]。與MCAO造模后6 h單獨(dú)使用tPA(10 mg/kg，靜脈注射)對(duì)大鼠進(jìn)行治療相比，tPA聯(lián)合法舒地爾(3 mg/kg，腹腔注射)治療可以改善再灌注18 h后的HT。降低再灌注7 d后的大鼠的死亡率，改善神經(jīng)功能。體外研究結(jié)果表明，法舒地爾與tPA聯(lián)合治療可以通過(guò)降低MMP-9活性減輕人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[20]。此外，乳酸脫氫酶相關(guān)實(shí)驗(yàn)還表明，法舒地爾不僅能對(duì)抗tPA誘導(dǎo)的急性和亞急性腦損傷也能保護(hù)受損內(nèi)皮細(xì)胞[20]。法舒地爾長(zhǎng)期神經(jīng)血管保護(hù)作用和改善tPA誘導(dǎo)的HT確切分子機(jī)制和與tPA聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的最佳劑量還有待進(jìn)一步研究[20]。

1.5 坎地沙坦

坎地沙坦是一種血管緊張素ⅡAT1受體拮抗劑，可以減少由缺血性腦卒中引起的損傷[21-22]。在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭?，在卒中? h給予坎地沙坦(1 mg/kg)和卒中后6 h給予tPA(10 mg/kg，靜脈注射)聯(lián)合治療，能減少腦出血并改善神經(jīng)功能[23]。研究顯示，與對(duì)照組相比，聯(lián)合治療可以減輕tPA治療腦缺血大鼠后的引起的顱內(nèi)出血，并且降低金屬基質(zhì)蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)含量，但對(duì)MMP-9無(wú)影響。此外，坎地沙坦和tPA聯(lián)合治療能降低核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)與腫瘤壞死因子 TNF-α的表達(dá)水平?？驳厣程沟闹委熯€能增強(qiáng)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的活性，其對(duì)血管功能的調(diào)節(jié)至關(guān)重要的，最終起到卒中后的神經(jīng)保護(hù)作用[24]。

1.6 苔蘚蟲(chóng)素

苔蘚蟲(chóng)素是自海洋生物草苔蟲(chóng)中提取的一種PKC活化劑，在中老年雌性大鼠MCAO造模后6 h給予治療能顯著降低缺血性腦損傷[25]。通過(guò)注入自體血栓制作雌性大鼠MCAO模型，造模后2 h給予苔蘚抑素(2.5 mg/kg，靜脈注射)能減少延遲tPA(5 mg/kg，靜脈注射)治療引起的腦腫脹、腦出血和24 h內(nèi)的死亡率[26]。苔蘚蟲(chóng)素也能減輕血腦屏障的破壞和出血性轉(zhuǎn)化，并下調(diào)MMP-9的表達(dá)，上調(diào)PKC?表達(dá)[26]。MMP-9調(diào)控蛋白激酶C的機(jī)制[27]可能在苔蘚蟲(chóng)素減少延遲tPA引起的HT和血腦屏障破壞起到了有益的作用。

2 促血管新生藥物

因?yàn)檠芷屏咽悄X出血的主要原因，血腦屏障的破壞是次要原因[28]。所以除保護(hù)血腦屏障的完整性外，促進(jìn)新生血管也可能減弱延遲tPA引起的HT。新生的血管可為神經(jīng)的新生提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并為新生的神經(jīng)細(xì)胞遷移到缺血周邊區(qū)域提供依附的支架，是梗死周邊區(qū)域腦組織抗損傷和神經(jīng)元修復(fù)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[28]。此外，研究表明血管新生發(fā)生在缺血區(qū)，有助于改善梗死、腦血流和神經(jīng)元功能的恢復(fù)[29]。

2.1 香豆素衍生物IMM-H004

香豆素類(lèi)化合物是一類(lèi)重要的具有多種生物活性的有機(jī)雜環(huán)化合物, 具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、抗菌抗病毒、抗凝血、松弛平滑肌、吸收紫外線(xiàn)和抗輻射等多種生物活性[30]。在卒中后6 h tPA(10 mg/kg，靜脈注射)與IMM-H004(6 mg/kg，靜脈注射)聯(lián)合治療能減少出血、大鼠腦梗死體積和腦水腫[31]。同樣有研究表明，在用線(xiàn)栓法制備的大鼠腦缺血模型中，聯(lián)合治療能減少tPA引起的HT和梗死體積[32]。腦缺血7 d后，IMM-H004能促進(jìn)血管生成，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，改善腦血流。體外實(shí)驗(yàn)表明，IMM-H004可以增加ATP和PKA的水平，并且在HBMECs和PC12細(xì)胞中激活A(yù)kt和PI3K，通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP/PKA和PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)血管新生[31]。作者認(rèn)為，IMM-H004能減少tPA治療引起的出血性轉(zhuǎn)化與促進(jìn)血管新生有關(guān)[31]。

2.2 粒細(xì)胞集落刺激因子

粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是能在體內(nèi)外調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞存活、增殖、分化以及成熟白細(xì)胞功能的一組糖蛋白生長(zhǎng)因子[32]。有研究表明，在誘導(dǎo)大鼠腦卒中后，將時(shí)間窗擴(kuò)大到6 h給予G-CSF(300 μg/kg，靜脈注射)與tPA(10 mg/kg，靜脈注射)聯(lián)合治療7 d與單獨(dú)使用tPA相比，能改善大鼠神經(jīng)功能和運(yùn)動(dòng)能力。此外使用G-SCF治療也降低了死亡率，減少延遲使用tPA引起的HT和血紅蛋白減少[33]。此外，能明顯增加缺血側(cè)大腦Ang-2、vWF、磷酸化eNOS、CD34+內(nèi)皮細(xì)胞和VEGFR-2的含量，并且改善大鼠24 h后神經(jīng)系統(tǒng)功能。因此，G-CSF通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮干細(xì)胞血管新生和修復(fù)的機(jī)制來(lái)降低延遲tPA引起的HT從而提高卒中后的神經(jīng)功能[33]。值得注意的是，在臨床研究中發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子如VEGF、Ang-1和G-CSF能增強(qiáng)動(dòng)脈再通和提高tPA治療急性缺血性腦卒中患者的臨床預(yù)后[34]。以上這些研究結(jié)果表明，G-CSF可以減少延遲tPA治療引起的HT。目前，關(guān)于G-CSF療效評(píng)價(jià)僅局限于急性腦卒中，其對(duì)腦血管保護(hù)的長(zhǎng)期療效還不清楚。G-CSF在腦卒中模型中的最佳劑量還在研究中[35]，并評(píng)價(jià)其聯(lián)合治療的效果，以期進(jìn)一步提高該方法的臨床應(yīng)用前景。

3 其他

目前，關(guān)于自由基與抗氧化劑[36]在延遲tPA治療時(shí)間窗中的作用也進(jìn)行了研究。此外，促紅細(xì)胞生成素在急性腦缺血中也被證實(shí)能改善神經(jīng)功能。維生素C與十二氟戊烷乳劑(dodecafluoropentane emulsion，DDFPe)等也有較多研究，但這些研究?jī)H證明了這些藥物干預(yù)措施能改善中風(fēng)，關(guān)于其對(duì)HT的影響目前尚未確定。

3.1 維生素C

局灶性缺血腦損傷后谷胱甘肽和抗壞血酸水平降低，自由基形成增加，從而加重血腦屏障的破壞，補(bǔ)充維生素C可以來(lái)改善缺血性腦損傷后的預(yù)后[36]。研究證明，維生素C具有中和自由基，特別是在腦實(shí)質(zhì)中保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能和抗氧化的作用，能對(duì)抗延遲tPA引起的不良反應(yīng)[37]。腦卒中后5 h，低劑量tPA(1 mg/kg)和維生素C(500 mg/kg)聯(lián)合治療組大鼠與單獨(dú)給予tPA組大鼠相比，卒中后48 h腦梗死體積和水腫明顯減少。同時(shí)，聯(lián)合治療也能減少延遲tPA引起的MMP-9水平增加和血腦屏障的損壞[37]。維生素C可能是通過(guò)中和自由基，來(lái)保護(hù)血腦屏障，從而減輕延遲tPA帶來(lái)的不良反應(yīng)和發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的功效，表明其具有擴(kuò)大tPA治療窗的輔助治療藥物的潛力。

3.2 DDFPe

DDFPe納米質(zhì)粒是一種氧運(yùn)輸?shù)鞍祝谀X缺血模型中可發(fā)揮腦保護(hù)作用。在新西蘭兔腦卒中栓塞模型中檢測(cè)DDFPe(0.3 mL/kg)能否延長(zhǎng)tPA治療時(shí)間窗(0.9 mg/kg，卒中后9 h給予)[38]，結(jié)果顯示聯(lián)合治療能將tPA治療時(shí)間窗有效延長(zhǎng)至9 h，并沒(méi)有增加出血轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。并且能改善在24 h后的神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積。但是其研究者只研究了9 h這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，關(guān)于其他時(shí)間點(diǎn)的療效和其他動(dòng)物模型還有待進(jìn)一步研究[38]。其作用機(jī)制可能是在在血細(xì)胞不足的時(shí)候改善了氧氣的運(yùn)輸，具體機(jī)制還有待研究。

3.3 促紅細(xì)胞生成素

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成，對(duì)心臟、神經(jīng)等組織器官具有抗凋亡，促進(jìn)血管再生等作用[39]。有研究表明重組人類(lèi)促紅細(xì)胞生成素對(duì)急性腦缺血有很好的治療效果[40]。局部血管內(nèi)注射tPA聯(lián)合低劑量截短寡糖鏈的Neuro-EPO可以減少大鼠腦缺血再灌注24 h的病死率，改善神經(jīng)功能，同時(shí)減少腦水腫和腦出血。而且Neuro-EPO沒(méi)有EPO的紅細(xì)胞生成功能，從而避免了血細(xì)胞比容增加導(dǎo)致的血液動(dòng)力學(xué)改變[41]。目前認(rèn)為大腦中動(dòng)脈低劑量注射促紅細(xì)胞生成素可能是通過(guò)激活A(yù)KT和ERK通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)與展望

本文探討了可以延長(zhǎng)tPA溶栓治療時(shí)間窗的藥物，以及能夠降低晚期溶栓治療引起的出血轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)的藥物。延長(zhǎng)時(shí)間窗進(jìn)行溶栓治療不僅可以通過(guò)藥物和干細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)，也可以通過(guò)其他非藥物途徑。通過(guò)腦成像技術(shù)可以確定出血轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)高的患者和臨床預(yù)后不良的患者，預(yù)測(cè)溶栓后的出血風(fēng)險(xiǎn)以改善tPA的治療時(shí)間窗和治療方法，提高安全性[42]。以前的試驗(yàn)還表明，血管內(nèi)手術(shù)，例如動(dòng)脈取栓，能改善卒中患者靜脈溶栓。近期，最新的一項(xiàng)研究表明，灌注成像可篩選出頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段或大腦中動(dòng)脈近段閉塞引起的急性缺血性卒中患者。這部分患者在超出tPA溶栓時(shí)間窗(發(fā)病6～24 h)的情況下仍可通過(guò)血管內(nèi)血栓切除術(shù)清除血栓改善臨床結(jié)局[43]。取栓加溶栓治療相比溶栓已被證明可以改善功能預(yù)后，降低患者的死亡率[44-45]。今后有可能在成像技術(shù)的指導(dǎo)下把握好治療時(shí)間窗，根據(jù)不同的個(gè)體情況，聯(lián)合應(yīng)用溶栓和神經(jīng)保護(hù)療法，以便能安全、有效的改善缺血性腦卒中患者的功能恢復(fù)。