豐富環(huán)境促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)可塑性的研究進(jìn)展①

呂富巖，張雷紅，宮兆帥，苑愛云

青島市婦女兒童醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科，山東青島市266034

圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是由各種原因引起的腦缺氧缺血所致，常危及生命，幸存者常遺留運(yùn)動(dòng)障礙、認(rèn)知障礙、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，給家庭和社會(huì)造成極大負(fù)擔(dān)。隨著搶救技術(shù)提高，HIBD患兒存活率增加，但致殘率并未降低。

未成熟腦較成人有更高的神經(jīng)可塑性，而腦功能重塑受病理生理及環(huán)境因素的共同影響。豐富環(huán)境干預(yù)是改善腦功能重塑重要而有效的手段之一，因低風(fēng)險(xiǎn)、低成本、無創(chuàng)性，已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

1 豐富環(huán)境與HIBD

豐富環(huán)境是針對(duì)嚙齒類動(dòng)物習(xí)性制備的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ铜h(huán)境，最早由Hebb提出[1]。他在研究中發(fā)現(xiàn)，暴露于豐富環(huán)境中的大鼠，水迷宮實(shí)驗(yàn)成績(jī)明顯提高，提示豐富環(huán)境可顯著改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。1978年豐富環(huán)境首次被正式定義：豐富環(huán)境是指存在多個(gè)干預(yù)因子的環(huán)境，是復(fù)雜的無生命物與社會(huì)刺激的復(fù)合體，不僅提供了運(yùn)動(dòng)機(jī)會(huì)和多感官刺激，而且賦予動(dòng)物個(gè)體間社交活動(dòng)的可能[2]。

豐富環(huán)境的動(dòng)物飼養(yǎng)籠較常規(guī)飼養(yǎng)籠大，多為85×85×75 cm大籠，每籠8～12只大鼠，籠內(nèi)放置不同顏色及形狀的物體，如檸檬、樹葉、木板、斜坡、秋千、管道、轉(zhuǎn)籠和玩具等?；\中擺放的物品每日更換位置，玩具每周更換2次。常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境籠舍小，相對(duì)“貧瘠”，無特殊刺激物品，僅放置水、食物和墊料。

相比標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，豐富環(huán)境下動(dòng)物居住條件具有復(fù)雜性和新穎性的特征。豐富環(huán)境作為一個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，被廣泛用于研究環(huán)境對(duì)腦發(fā)育、認(rèn)知和腦損傷后神經(jīng)修復(fù)的影響。Birch等[3]發(fā)現(xiàn)，豐富環(huán)境干預(yù)的正常大鼠記憶力較未干預(yù)者高，并能抑制大鼠衰老過程中記憶力下降。對(duì)HIBD大鼠的研究發(fā)現(xiàn)[4-8]，與標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境相比，豐富環(huán)境可顯著提高HIBD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、運(yùn)動(dòng)平衡協(xié)調(diào)能力及環(huán)境適應(yīng)能力。

豐富環(huán)境在動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境中增加了學(xué)習(xí)經(jīng)歷、身體活動(dòng)、感覺輸入及社交活動(dòng)等，可能通過調(diào)控突觸可塑性相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)因子、自噬相關(guān)因子等，增強(qiáng)突觸的形態(tài)及功能，促進(jìn)HIBD后神經(jīng)功能重塑。

2 豐富環(huán)境與突觸可塑性

2.1 突觸的形態(tài)及功能

突觸可塑性是未成熟腦神經(jīng)可塑性的重要表現(xiàn)[9]，包括功能和形態(tài)的可塑性。海馬區(qū)突觸連接在接受一定量強(qiáng)化刺激后，有在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持高于刺激前的突觸效能增強(qiáng)現(xiàn)象，即長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)，電生理表現(xiàn)為場(chǎng)興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)增強(qiáng)。LTP可誘導(dǎo)突觸大小、數(shù)量及功能改變。樹突棘作為突觸后形態(tài)結(jié)構(gòu)，是神經(jīng)元信息交換的主要位點(diǎn)，海馬錐細(xì)胞樹突棘的結(jié)構(gòu)和功能被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的細(xì)胞基礎(chǔ)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，豐富環(huán)境干預(yù)可通過促進(jìn)海馬區(qū)LTP，提高fEPSP，促進(jìn)神經(jīng)功能重塑，并提高腦損傷后學(xué)習(xí)及記憶能力的恢復(fù)[10-12]。Malik等[11]發(fā)現(xiàn)，豐富環(huán)境干預(yù)3周后，HIBD大鼠損傷側(cè)大腦皮層厚度及樹突棘數(shù)量均顯著增加。

何種豐富環(huán)境干預(yù)強(qiáng)度效果最佳存在爭(zhēng)議。每天1 h、每周6 d、持續(xù)9周的方案可改善HIBD大鼠認(rèn)知，抑制海馬神經(jīng)元樹突棘丟失，但不能逆轉(zhuǎn)海馬萎縮[13]；有學(xué)者認(rèn)為，豐富環(huán)境的數(shù)量及強(qiáng)度并非越多越好[14]。豐富環(huán)境干預(yù)的機(jī)制及干預(yù)強(qiáng)度，以及對(duì)HIBD大鼠認(rèn)知及海馬突觸形態(tài)、功能的影響及分子基礎(chǔ)，均有待進(jìn)一步明確。

2.2 突觸可塑性相關(guān)蛋白

豐富環(huán)境對(duì)HIBD的修復(fù)作用已得到公認(rèn)，并發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境對(duì)未成熟腦可塑性的積極影響可能與促進(jìn)突觸相關(guān)分子的表達(dá)相關(guān)[3,9,15]。

突觸素作為突觸重塑的特異性標(biāo)志物，參與突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)遞質(zhì)釋放，可準(zhǔn)確反映突觸的分布和密度。研究發(fā)現(xiàn)[3]，豐富環(huán)境干預(yù)的正常大鼠記憶力及海馬突觸素表達(dá)明顯較未干預(yù)者高，且呈時(shí)間依賴性；長(zhǎng)期間歇豐富環(huán)境干預(yù)可抑制大鼠衰老過程中記憶力下降。本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，豐富環(huán)境干預(yù)(每天12 h，連續(xù)14 d)可增強(qiáng)HIBD幼鼠海馬區(qū)突觸素的表達(dá)，但HIBD后不同豐富環(huán)境干預(yù)強(qiáng)度對(duì)大鼠認(rèn)知及突觸素的影響尚不清楚。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2,FGF-2)是一種神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子，也可調(diào)節(jié)突觸可塑性和軸突分支，受到高度關(guān)注[16]。FGF-2可通過突觸可塑性提高正常腦的學(xué)習(xí)能力及損傷腦的記憶恢復(fù)[17]。豐富環(huán)境可促進(jìn)大腦FGF-2表達(dá)[9]，但干預(yù)強(qiáng)度對(duì)HIBD大鼠海馬FGF-2表達(dá)的影響目前研究較少。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是腦發(fā)育的關(guān)鍵分子，通過與其特異性受體TrkB結(jié)合發(fā)揮作用，參與突觸重塑及學(xué)習(xí)記憶。BDNF受諸多因子調(diào)節(jié)，最重要的是環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responsive element binding protein,CREB)。CREB作為細(xì)胞核內(nèi)第三信使之一，在應(yīng)激刺激后可誘導(dǎo)Ser-133位磷酸化，激活轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)。CREB對(duì)鞏固LTP和長(zhǎng)期記憶也起重要作用。生理劑量的BDNF對(duì)記憶有促進(jìn)作用，過高或過低BDNF打破了抑制性和興奮性神經(jīng)傳遞的平衡，對(duì)學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生消極作用。有研究發(fā)現(xiàn)[18]，過表達(dá)BDNF的轉(zhuǎn)基因小鼠在成年后出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)障礙，內(nèi)源性BDNF慢性增加亦可促進(jìn)海馬齒狀回苔蘚纖維芽生，進(jìn)而干擾突觸重塑。豐富環(huán)境可明顯促進(jìn)HIBD大鼠海馬BDNF表達(dá)[15,19]，但過度豐富環(huán)境干預(yù)是否會(huì)造成BDNF過表達(dá)，從而對(duì)突觸重塑及認(rèn)知產(chǎn)生負(fù)面影響，尚未可知。

3 豐富環(huán)境與細(xì)胞凋亡

神經(jīng)元凋亡途徑參與未成熟腦的可塑性[20-21]。Bcl-2和Bax是經(jīng)典的凋亡抑制基因及凋亡促進(jìn)基因[22-23]。對(duì)成年大鼠的研究表明，豐富環(huán)境干預(yù)可下調(diào)凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)[21]，上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)[20]，促進(jìn)衰老大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生[21]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，豐富環(huán)境干預(yù)可顯著提高HIBD大鼠缺血缺氧側(cè)海馬Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax表達(dá)。但豐富環(huán)境干預(yù)后未成熟腦海馬神經(jīng)元凋亡調(diào)控基因的表達(dá)變化及其確切機(jī)制尚不清楚。宮陽陽等[24]發(fā)現(xiàn)，豐富環(huán)境干預(yù)后，HIBD大鼠損傷側(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)尼氏小體增多，提示豐富環(huán)境干預(yù)可以促使未死亡的神經(jīng)元通過尼氏小體重現(xiàn)，逐步恢復(fù)代謝，參與軸突修復(fù)和生長(zhǎng)，促進(jìn)腦功能重塑。

4 豐富環(huán)境與細(xì)胞自噬

自噬指細(xì)胞利用溶酶體、吞噬泡降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程[25-26]，被稱為Ⅱ型程序性死亡。自噬具有兩面性，基礎(chǔ)水平的自噬是細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制，但自噬過度可導(dǎo)致代謝應(yīng)激、細(xì)胞死亡等災(zāi)難性后果。

缺氧缺血等應(yīng)激性刺激可誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬，自噬過程受多種自噬相關(guān)蛋白調(diào)控。Beclin-1是自噬啟動(dòng)的關(guān)鍵分子，可調(diào)節(jié)其他自噬蛋白定位至前自噬體膜上，是自噬重要的正調(diào)節(jié)因子。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1light chain 3,LC3)是自噬體膜的標(biāo)記物，LC3-Ⅰ通常存在于胞漿中，自噬激活時(shí)向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化并轉(zhuǎn)移到自噬體膜；LC3-Ⅱ水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可提示自噬活性[27]。P62是自噬的底物，反映自噬潮的情況，其水平與自噬活性負(fù)相關(guān)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)生理功能，包括突觸重塑、記憶及細(xì)胞自噬等[28]。正常狀態(tài)下，mTOR1處于激活狀態(tài)，直接抑制自噬，是自噬的負(fù)性調(diào)控因子。雷帕霉素作為mTOR1抑制劑，可激活自噬。

生理狀態(tài)下，自噬參與記憶及突觸發(fā)育的調(diào)控[25,29]。對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)病理狀態(tài)下自噬的研究多集中于神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病及精神類疾病，且認(rèn)為自噬對(duì)突觸可塑性及認(rèn)知功能有保護(hù)作用[25,30]。Otabe等[31]對(duì)抑郁癥大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，電刺激可通過增加海馬區(qū)自噬、提高BDNF的表達(dá)，改善突觸可塑性。Takahashi等[30]對(duì)創(chuàng)傷性應(yīng)激障礙大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，豐富環(huán)境干預(yù)2周后，海馬區(qū)LC3-Ⅱ、BDNF表達(dá)顯著增加，且大鼠麻木回避行為隨之改善，說明豐富環(huán)境干預(yù)可通過增加海馬區(qū)自噬改善大鼠的精神行為。

自噬在HIBD中作用卻存在矛盾的觀點(diǎn)。Lu等[32]對(duì)7日齡大鼠海馬腦片的體外研究發(fā)現(xiàn)，糖氧剝奪后，海馬腦片自噬體增加、LC3-Ⅱ表達(dá)增高；加用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤后，自噬體形成及LC3-Ⅱ水平降低，腦損傷明顯減輕，認(rèn)為海馬區(qū)自噬上調(diào)可加重?fù)p傷。Xu等[33]發(fā)現(xiàn)，抑制自噬可降低HIBD后大鼠海馬區(qū)損傷。Au等[17]亦發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)的自噬可加重未成熟大鼠小腦浦肯野細(xì)胞損傷，抑制自噬可促進(jìn)浦肯野細(xì)胞存活，并改善大鼠平衡功能。而Papadakis等[34]卻發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血誘導(dǎo)的自噬可通過增加神經(jīng)元對(duì)缺氧的耐受性，發(fā)揮保護(hù)作用。自噬在HIBD中的作用有待進(jìn)一步研究，而豐富環(huán)境干預(yù)是否對(duì)HIBD海馬區(qū)自噬產(chǎn)生影響，鮮有報(bào)道。

5 小結(jié)

豐富環(huán)境對(duì)HIBD的修復(fù)作用已得到公認(rèn)，并發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境可能通過調(diào)控突觸可塑性(突觸相關(guān)分子、突觸的形態(tài)及功能)、神經(jīng)元凋亡及細(xì)胞自噬過程，改善HIBD后神經(jīng)可塑性，促進(jìn)HIBD后神經(jīng)功能修復(fù)。豐富環(huán)境作為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，為臨床豐富環(huán)境康復(fù)方案的制定提供了理論基礎(chǔ)；豐富環(huán)境作為一種低風(fēng)險(xiǎn)、低成本、無創(chuàng)性康復(fù)手段，在臨床康復(fù)中必將擁有良好的應(yīng)用前景。但目前對(duì)豐富環(huán)境干預(yù)的時(shí)機(jī)及豐富環(huán)境干預(yù)強(qiáng)度的選擇存在爭(zhēng)議，而且自噬調(diào)控在不同病理生理狀態(tài)下存在兩面性。未來研究需進(jìn)一步闡明豐富環(huán)境干預(yù)強(qiáng)度對(duì)HIBD大鼠海馬區(qū)自噬、突觸可塑性的影響及內(nèi)在機(jī)制，探索最佳豐富環(huán)境干預(yù)強(qiáng)度，從而為臨床康復(fù)方案制定提供參考。

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