《中華人民共和國(guó)藥典》收錄毒性中藥材生殖毒性研究進(jìn)展

楊 威，肖百全，喻 祥，韓 玲

（1.廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510260；2.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心，北京 1000381；3.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東廣州 510990）

毒性中藥材在我國(guó)有著廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)，臨床應(yīng)用時(shí)間久遠(yuǎn)，在多個(gè)疾病領(lǐng)域（如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。長(zhǎng)期以來，中藥毒性研究一直未受到應(yīng)有的重視，生殖毒性作為中藥毒性研究的重要組成部分也未受到應(yīng)有的重視，毒性中藥材及其飲片生殖毒性的研究較少，這給臨床用藥帶來較大的安全隱患。隨著國(guó)家對(duì)藥品質(zhì)量要求的不斷提高，人們對(duì)中藥材的安全性特別是毒性中藥材的安全性有了新的要求，這必將推動(dòng)中藥安全性研究的全面提高。本文就《中華人民共和國(guó)藥典》（2015）（以下簡(jiǎn)稱《藥典》）記載的83種毒性中藥材及其飲片的生殖毒性研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 《藥典》中標(biāo)注的毒性中藥材

《藥典》中共收載83種毒性中藥材［1］，其中10種標(biāo)注為“大毒”，42 種“有毒”，31 種“小毒”。“大毒”藥材與飲片有川烏、馬錢子、馬錢子粉、天仙子、巴豆、巴豆霜、紅粉、鬧羊花、草烏和斑蝥?！坝卸尽彼幉呐c飲片有干漆、土荊皮、山豆根、千金子、千金子霜、制川烏、天南星、制天南星、木鱉子、甘遂、仙茅、白附子、白果、半夏、朱砂、華山參、全蝎、芫花、蒼耳子、兩頭尖、附子、苦楝皮、金錢白花蛇、京大戟、制草烏、牽牛子、輕粉、香加皮、洋金花、常山、商陸、硫黃、雄黃、蓖麻子、蜈蚣、罌粟殼、蘄蛇、蟾酥、三棵針、白屈菜、臭靈丹草和狼毒?！靶《尽彼幉呐c飲片有丁公藤、九里香、土鱉蟲、川楝子、小葉蓮、水蛭、艾葉、北豆根、地楓皮、紅大戟，兩面針、吳茱萸、苦木、苦杏仁、草烏葉、南鶴虱、鴉膽子、重樓、急性子、蛇床子、豬牙皂、綿馬貫眾、綿馬貫眾炭、蒺藜、鶴虱、大皂角、飛揚(yáng)草、金鐵鎖、紫萁貫眾、榼藤子和翼首草。

2 毒性中藥材按功能主治的分類

在上述83種毒性中藥材中，“祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛”類藥物有19種：川烏、草烏、鬧羊花、制川烏、兩頭尖、金錢白花蛇、制草烏、蜈蚣、全蝎、蘄蛇、丁公藤、金鐵鎖、翼首草、蛇床子、香加皮、仙茅、蒼耳子、蒺藜和榼藤子?！熬轮鹚[散結(jié)通便”類藥物有14種：巴豆、巴豆霜、馬錢子、馬錢子粉、千金子、千金子霜、甘遂、芫花、京大戟、商陸、紅大戟、牽牛子、輕粉和蓖麻子?！盎钛蒲⒅痧錾⒔Y(jié)”類藥物有12種：斑蝥、干漆、木鱉子、狼毒、水蛭、急性子、土鱉蟲、九里香、小葉蓮、兩面針、天南星和制天南星。“解痙，平喘，安神”類藥物有7種：天仙子、朱砂、白果、華山參、洋金花、白屈菜和苦杏仁?！皻⑾x消積”類藥物有9種：土荊皮、苦楝皮、硫黃、雄黃、川楝子、南鶴虱、綿馬貫眾、鶴虱和紫萁貫眾?！办钐怠鳖愃幬镉?種：白附子、半夏、常山、臭靈丹草、豬牙皂和大皂角?！扒鍩峤舛尽鳖愃幬镉?0種：山豆根、蟾酥、北豆根、地楓皮、苦木、草烏葉、鴉膽子、重樓、飛揚(yáng)草和臭靈丹草?！皽亟?jīng)散寒”類藥物有3種：附子、艾葉和吳茱萸。其他功能藥物有3種：罌粟殼、綿馬貫眾炭和紅粉。從上述功能主治分類可見，毒性中藥材的分布相對(duì)比較集中，主要集中在祛風(fēng)濕藥、峻下逐水藥、活血破血藥、殺蟲消積藥、祛痰藥和清熱解毒藥。

3 “大毒”中藥材與飲片的生殖毒性研究

毒性中藥材及飲片生殖毒性研究最常用的方法是生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)（Ⅰ段）和胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)（Ⅱ段）［2］，未見圍生期毒性試驗(yàn)（Ⅲ段）相關(guān)報(bào)道。但隨著研究手段的進(jìn)步，也有部分學(xué)者使用斑馬魚、胚胎組織和細(xì)胞等手段開展毒性中藥材的生殖毒性研究。已報(bào)道的開展過生殖毒性研究的“大毒”類中藥材及其飲片主要有川烏、草烏、馬錢子和斑蝥，其他藥物關(guān)于生殖毒性的研究報(bào)道較少。為便于闡述和理解，以下總結(jié)毒性研究結(jié)果時(shí)，將具有相似藥理作用和具有相似臨床適應(yīng)證的藥物合并敘述。

3.1 川烏和草烏

3.1.1生殖系統(tǒng)毒性研究

川烏和草烏同屬烏頭類中藥，主要化學(xué)成分有烏頭堿和烏頭次堿等，具有溫經(jīng)散寒止痛、祛風(fēng)除濕等功效。關(guān)于川烏和草烏生殖毒性研究?jī)?nèi)容較少，僅有關(guān)于雄性大鼠生殖系統(tǒng)毒性研究報(bào)道。張建軍［3］研究發(fā)現(xiàn)，2～4周齡雄性SD大鼠ig給予生川烏3.3，6.5和13.0 g生藥·kg-1或生草烏2.1，4.2和8.3 g生藥·kg-1，連續(xù)3個(gè)月，停藥恢復(fù)觀察1個(gè)月。給藥結(jié)束時(shí)生草烏13.0 g生藥·kg-1組能顯著降低睪丸和附睪臟器系數(shù)，其他各組對(duì)睪丸和附睪臟器系數(shù)無明顯影響；停藥恢復(fù)1個(gè)月后，各組睪丸和附睪臟器系數(shù)未見明顯差異，提示烏頭類中藥對(duì)大鼠睪丸和附睪臟器系數(shù)的影響是可逆的。給藥結(jié)束和恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，各劑量組睪丸和附睪組織未發(fā)現(xiàn)病理改變，提示生川烏和生草烏的主要毒性靶器官不是生殖器官。體外研究結(jié)果表明，烏頭堿0.05，0.5，5和50 g·L-1均可促進(jìn)支持細(xì)胞（sertoli）分泌乳酸，且5 g·L-1作用最強(qiáng)；5和50 g·L-1可抑制大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖。但烏頭堿0.05，0.5，5和50 g·L-1對(duì)大鼠睪丸間充質(zhì)（leydig）細(xì)胞活力、脂質(zhì)過氧化水平以及睪酮分泌功能均未見明顯影響［3］。該研究的不足之處在于未進(jìn)行雄性大鼠生育力和精子功能檢測(cè)，也未對(duì)雌性大鼠的生育力和早期胚胎發(fā)育毒性進(jìn)行研究，不能明確說明生草烏和生川烏對(duì)大鼠生育力和早期胚胎發(fā)育是否具有毒性作用。

3.1.2胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究

肖凱［4］研究發(fā)現(xiàn)，生川烏和生草烏分別以8.3和13.0 g生藥·kg-1（最大給藥量）于妊娠期7～16 d（gestation day 7～16，GD7～16）給予雌性SD大鼠，未觀察到生川烏對(duì)大鼠母體毒性、胚胎和胎仔毒性。生草烏給藥后胎鼠身長(zhǎng)縮短，胸骨骨化數(shù)減少，但未見畸形，顯示出一定的胚胎毒性。但由于出現(xiàn)了母體毒性（體質(zhì)量降低，攝食減少），且只設(shè)1個(gè)劑量組，無法判斷毒性反應(yīng)是否具有劑量-毒性關(guān)系，而胎仔出現(xiàn)的毒性多與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，未見明顯的畸形。因此，該文作者認(rèn)為生草烏的致畸性尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。應(yīng)用全胚胎培養(yǎng)技術(shù)的體外研究結(jié)果表明，生草烏在劑量＞1.25 g生藥·L-1、烏頭堿在劑量＞2.5 mg生藥·L-1時(shí)，對(duì)10.5日齡大鼠體外胚胎具有明顯毒性和致畸性；加入體外代謝活化系統(tǒng)可減輕其毒性［4］。該作者認(rèn)為生草烏和烏頭堿引起體外胚胎發(fā)育毒性的重要機(jī)制之一可能與卵黃囊生長(zhǎng)發(fā)育和血管分化的抑制有關(guān)。黃韌［5］研究發(fā)現(xiàn)，在器官形成期（GD6～17）給予生川烏13.0 g生藥·kg-1可降低孕小鼠子宮內(nèi)膜厚度和子宮胎仔胎盤總重，減少活胎數(shù)，增加吸收胎數(shù)。由于該研究未進(jìn)行劑量-毒性相關(guān)性研究，也未對(duì)胎仔的外觀、內(nèi)臟和骨骼畸形方面進(jìn)行研究，因此，尚不能較好地反映生川烏的致畸性。

上述3項(xiàng)研究通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)觀察了生川烏和生草烏的致畸作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生川烏未見明顯的胚胎和胎仔發(fā)育毒性，但生草烏是否有胚胎和胎仔發(fā)育毒性尚未明確。

3.2 馬錢子

馬錢子主要化學(xué)成分有番木鱉堿（士的寧）和馬錢子堿等，具有消腫、止痛等作用，關(guān)于其生殖毒性研究報(bào)道較少，僅張啟春等［6］采用斑馬魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，考察了馬錢子主要成分馬錢子堿及其氮氧化物的胚胎發(fā)育毒性。研究結(jié)果表明，馬錢子堿0.1，0.2，0.5，1.0和2.0 mmol·L-1、馬錢子堿氮氧化物0.5，1.0和2.0 mmol·L-1均可明顯降低斑馬魚的孵化率；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿0.2 mmol·L-1處理過的魚卵有脊柱側(cè)彎、心包水腫和黑色素少等現(xiàn)象，而馬錢子堿氮氧化物濃度增加到1.0 mmol·L-1時(shí)才有個(gè)別魚卵出現(xiàn)了脊柱側(cè)彎和心包水腫等現(xiàn)象。吖啶橙染色后發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿熒光表達(dá)顯著，主要表現(xiàn)在頭部（大腦和小腦）、晶狀體、視網(wǎng)膜和腹部。該研究提示，馬錢子堿及其氮氧化物對(duì)斑馬魚具有一定的致畸性，但其氮氧化物的毒性明顯低于馬錢子堿。

該研究通過斑馬魚來考察藥物的致畸作用，是一種比較創(chuàng)新的方法，研究的結(jié)果也提示馬錢子具有致畸風(fēng)險(xiǎn)。不足之處在于未說明其使用的斑馬魚實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)是否已經(jīng)過已知的、不同作用機(jī)制的陽性藥物驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的可靠性尚需進(jìn)一步論證。

3.3 斑蝥

斑蝥主要含有斑蝥素等化學(xué)成分，具有破血逐瘀、散結(jié)消瘸、攻毒蝕瘡等功效，目前對(duì)其胚胎和胎仔發(fā)育毒性研究報(bào)道較少。簫慶慈等［7］研究發(fā)現(xiàn)，交配前，雌性小鼠ig給予斑蝥水提物30和60 mg·kg-1連續(xù)5 d，交配后連續(xù)給藥19 d，可引起雌性小鼠妊娠率明顯降低，畸胎率明顯升高；此外，還可引起雄性小鼠睪丸系數(shù)明顯降低，精囊腺臟器系數(shù)明顯降低。該研究提示，斑蝥具有明顯的生殖毒性。該研究給藥期覆蓋了交配前雌性動(dòng)物的一個(gè)動(dòng)情周期和受孕后著床、胚胎發(fā)育的全過程，可比較明確地判斷斑蝥具有致畸作用。此外，該研究結(jié)果還提示，斑蝥可能對(duì)雄性動(dòng)物的生育力也具有毒性作用。

4 “有毒”中藥材與飲片的生殖毒性研究

4.1 仙茅和蒼耳子

祛風(fēng)濕類“有毒”中藥材及飲片中，進(jìn)行了生殖毒性研究的主要有仙茅和蒼耳子。前者研究的內(nèi)容為生殖器官毒性，后者為致畸性。鮑薈竹［8］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠ig給予仙茅乙醇提取物30和120 g生藥·kg-1，連續(xù)30 d，血清卵泡刺激素顯著升高；120 g生藥·kg-1組睪丸和卵巢細(xì)胞發(fā)生損傷，胞漿和細(xì)胞核內(nèi)線粒體腫脹，成空泡狀，染色質(zhì)輕度聚集在細(xì)胞核內(nèi)。陳錫強(qiáng)等［9］研究發(fā)現(xiàn)，蒼耳子提取物能夠顯著降低斑馬魚的胚胎孵化率，增加死亡率及心臟畸形等毒性體征，并隨濃度的增加毒性增強(qiáng)。由于未考察動(dòng)物生育力和早期胚胎發(fā)育毒性、也未考察動(dòng)物的胚胎-胎仔發(fā)育毒性和圍生期發(fā)育毒性，仙茅和蒼耳子的文獻(xiàn)研究結(jié)果僅能提示二者可能存在一定的生殖毒性風(fēng)險(xiǎn)，而不能明確判斷二者是否具有生殖毒性。

4.2 半夏

半夏具有良好的降逆止嘔作用，故常作為治療嘔吐的藥物，而妊娠嘔吐又是孕早期婦女易出現(xiàn)的臨床表現(xiàn)。金元時(shí)期易水學(xué)派創(chuàng)始人張?jiān)仃P(guān)于孕期婦女服用半夏也有相關(guān)的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，即“半夏動(dòng)胎”，認(rèn)為妊娠期婦女服用未炮制過的半夏后易引起胎動(dòng)不安?，F(xiàn)代關(guān)于半夏生殖毒性的研究?jī)?nèi)容主要涉及抗早孕和致畸性。

4.2.1抗早孕

從生殖毒性的角度，可認(rèn)為抗早孕是早期胚胎發(fā)育毒性作用，主要表現(xiàn)在對(duì)胚胎著床前和著床的毒性作用。楊守業(yè)等［10］研究發(fā)現(xiàn)，生半夏粉9 g生藥·kg-1、生半夏湯劑和制半夏湯劑30 g生藥·kg-1ig給予大鼠，均引起妊娠大鼠陰道出血顯著增加，而制半夏粉和法半夏粉（9 g生藥·kg-1）未見該作用，說明炮制可降低生半夏抗早孕的毒性作用。陳蕙玲等［11］研究發(fā)現(xiàn)，半夏蛋白具有抗早孕的作用，兔宮內(nèi)注射500 μg半夏蛋白抗著床率達(dá)100%，經(jīng)半夏蛋白作用后的子宮內(nèi)膜未能使移植的正常胚胎著床。有學(xué)者認(rèn)為，半夏引起流產(chǎn)是由于降低卵巢黃體功能活性、內(nèi)源性孕酮分泌功能減弱而造成的［12］。半夏生殖毒性的研究結(jié)果與“半夏動(dòng)胎”的醫(yī)學(xué)理論相符，妊娠期婦女服用半夏易引起先兆流產(chǎn)和流產(chǎn)［13-14］。

4.2.2胚胎-胎仔發(fā)育毒性

楊守業(yè)等［10］研究發(fā)現(xiàn)，半夏各種飲片引起胎仔畸形較少見，但可引起胎兒發(fā)育不均衡以及胎仔骨骼發(fā)育遲緩；制半夏湯劑毒性作用與生半夏粉相似。楊守業(yè)等［13］還發(fā)現(xiàn)，生半夏粉末以9 g生藥·kg-1給藥、制半夏湯劑在劑量為15 g生藥·kg-1時(shí)對(duì)大鼠妊娠和胚胎有顯著的毒性，孕早期給藥毒性以死胎增加為主，孕中晚期給藥則以陰道出血和死胎增加為主。王浩等［14］研究發(fā)現(xiàn)，半夏茯苓湯中生半夏的致畸胎率為5.38%，致死胎率為4.30%，均高于姜半夏組（畸胎率4.13%，死胎率4.13%）和法半夏組（畸胎率3.03%，死胎率2.27%）。半夏茯苓湯中用法半夏入藥最為安全，孕婦需慎用未經(jīng)炮制的生半夏復(fù)方。此外，還有研究表明，生半夏混懸液以6 g生藥·kg-1給藥時(shí)可出現(xiàn)孕小鼠死亡，體質(zhì)量減輕，胎仔尾長(zhǎng)變短［15-16］；而生半夏湯劑僅能縮短胎仔尾長(zhǎng)，其結(jié)果與楊守業(yè)等［13］的研究結(jié)果相吻合。

上述研究結(jié)果表明，生半夏的抗早孕（早期胚胎發(fā)育毒性）和胚胎-胎仔發(fā)育毒性比較明確，在經(jīng)過炮制后毒性可明顯降低，但生半夏對(duì)生育力和圍生期毒性研究尚未見相關(guān)報(bào)道。由于半夏在臨床上使用量比較大，而國(guó)內(nèi)患者不良反應(yīng)報(bào)告意識(shí)比較薄弱，其生殖毒性研究亟需補(bǔ)充。

4.3 朱砂和輕粉

4.3.1生育力和早期胚胎發(fā)育毒性

朱砂和輕粉的主要成分為可溶性汞和游離汞，前者主要用于安神，后者外用用于殺蟲斂瘡。谷穎敏等［17］和顧祖曦等［18］研究發(fā)現(xiàn)，朱砂0.1，0.3和1.0 g生藥·kg-1ig給予大鼠，雄性大鼠由交配前連續(xù)給藥6周，并持續(xù)至交配結(jié)束；雌性大鼠由交配前2周給藥并持續(xù)至GD6。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，朱砂各劑量組雄性大鼠生育力未見明顯改變。但朱砂具有親本毒性作用，可引起雄性大鼠血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、總蛋白和白蛋白含量降低，肺和肝系數(shù)增大，睪丸和精囊腺減輕。組織病理學(xué)觀察顯示，朱砂1.0 g生藥·kg-1組雄性大鼠精囊腺和睪丸萎縮，曲細(xì)精管變細(xì)，管腔間排列疏松，管腔內(nèi)基底膜破壞，其他臟器未見明顯病變；朱砂0.1和0.3 g生藥·kg-1組雄性大鼠精子功能降低，1.0 g生藥·kg-1組未見明顯改變。朱砂1.0 g生藥·kg-1組雌性大鼠著床前胚胎流失率升高，平均活胎數(shù)下降，未見明顯親本毒性，作者分析雌性大鼠未出現(xiàn)母體毒性的原因可能與雌性大鼠給藥時(shí)間較短有關(guān)，而非性別差異。該研究采用了典型的大鼠Ⅰ段生殖毒性實(shí)驗(yàn)考察了朱砂對(duì)生育力和早期胚胎發(fā)育的影響，明確了朱砂對(duì)大鼠生育力和早期胚胎發(fā)育的未觀察到損害作用劑量（no observed adverse effect level，NOAEL），對(duì)朱砂的臨床應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

李永剛等［19］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠大劑量外用輕粉制劑“五五丹”后出現(xiàn)生殖器官組織結(jié)構(gòu)改變，如子宮體積明顯減小，卵泡數(shù)明顯減少，黃體細(xì)胞變小且形態(tài)不規(guī)則；睪丸曲細(xì)精管縮小，生精細(xì)胞減少等。以上研究表明，含汞制劑特別是含氧化汞的制劑長(zhǎng)期給藥可產(chǎn)生明顯的生殖毒性。

4.3.2胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究

輕粉的胚胎-胎仔發(fā)育毒性作用未見相關(guān)報(bào)道，而朱砂則進(jìn)行了比較全面的研究。如梁愛華等［20］研究發(fā)現(xiàn)，通過從D6～GD19和交配前14 d～GD192種給藥時(shí)間考察朱砂的大鼠胚胎毒性，朱砂劑量分別為0.08，0.4和4.0 g生藥·kg-1。結(jié)果顯示，朱砂各劑量在D6～GD19給藥時(shí)間內(nèi)對(duì)母鼠未見母體毒性作用，對(duì)胎仔的活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)、胎仔的外觀、內(nèi)臟和骨骼均未見明顯毒性。而于交配前14 d～GD19給藥，朱砂各劑量組出現(xiàn)胸骨和肋股畸形，有明顯劑量依賴關(guān)系，但各劑量對(duì)母鼠、胎仔活胎率和死胎率均未見明顯影響。米金霞等［21］研究發(fā)現(xiàn)，朱砂以0.1，0.3和1.0 g生藥·kg-1于GD6～15ig給予大鼠，各劑量組未見明顯母體毒性，對(duì)胚胎和胎仔也未見明顯毒性。

上述2篇報(bào)道均對(duì)朱砂的胚胎和胎仔發(fā)育毒性進(jìn)行了研究，差別在于梁愛華等［20］給藥期限覆蓋面更寬，給藥劑量更大，其給藥期限包括了雌性大鼠生育力期限的考察（交配前14 d開始給藥）。因此，該兩項(xiàng)報(bào)道結(jié)果也存在少許差異，但均得出胚胎和胎仔發(fā)育毒性的NOAEL劑量，對(duì)朱砂的臨床應(yīng)用均具有明確的指導(dǎo)價(jià)值。

4.3 芫花和甘遂

巴豆、甘遂、大戟、芫花、商路和千金子等“峻下逐水”藥生殖毒性相關(guān)報(bào)道較少，僅芫花和甘遂有相關(guān)報(bào)道，具體研究?jī)?nèi)容為生殖器官毒性研究和利用斑馬魚進(jìn)行致畸研究。如趙一等［22］研究發(fā)現(xiàn)，芫花酯甲和醋炙芫花酯甲在濃度為1 μg生藥·L-1時(shí)對(duì)妊娠和非妊娠子宮平滑肌均具有明顯的收縮作用，且對(duì)妊娠子宮平滑肌的作用強(qiáng)于非妊娠子宮。向麗華等［23］研究發(fā)現(xiàn)，芫花能增加雄性大鼠睪丸系數(shù)和雌性大鼠卵巢系數(shù)。文獻(xiàn)研究結(jié)果表明，芫花可能存在一定的生殖毒性風(fēng)險(xiǎn)，但芫花缺乏系統(tǒng)的生殖毒性研究，該結(jié)果對(duì)芫花臨床應(yīng)用的指導(dǎo)作用比較有限。樓堅(jiān)偉等［24］在醋甘遂活性部分各成分群對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性比較研究發(fā)現(xiàn)，成分群B（巨大戟烷型二萜類）能導(dǎo)致斑馬魚胚胎孵化過程中卵黃囊吸收延遲、脊柱彎曲、囊腔腫大、肝及胃腺腸道發(fā)育不良、心腔腫大和血液循環(huán)減緩等癥狀。該研究結(jié)果顯示，成分群B對(duì)于斑馬魚胚胎有明顯的發(fā)育毒性。該結(jié)果提示，甘遂可能存在生殖毒性風(fēng)險(xiǎn)。該研究存在的問題與前述使用斑馬魚進(jìn)行致畸性研究存在的問題相似。

4.4 土荊皮、苦楝皮和雄黃

“殺蟲消積”類藥物進(jìn)行過生殖毒性研究主要有土荊皮、苦楝皮和雄黃，主要研究?jī)?nèi)容有抗早孕和胚胎、胎仔發(fā)育毒性研究。

4.4.1抗早孕

有部分學(xué)者對(duì)土荊皮和苦楝皮進(jìn)行了抗早孕（早期胚胎發(fā)育毒性）相關(guān)研究。王偉成等［25］研究發(fā)現(xiàn)，土荊皮的主要成分土荊皮甲酸在灌胃（大鼠30 mg·kg-1；犬0.1～0.2 mg·kg-1）、皮下注射（大鼠40 mg·kg-1）和陰道給藥（大鼠10～20 mg·kg-1）均發(fā)現(xiàn)了抗早孕和抗中孕作用，但對(duì)抗著床作用不明顯，對(duì)大鼠和犬的抗早孕作用強(qiáng)于倉鼠，抗早孕作用主要體現(xiàn)在死胎數(shù)增加。張建樓等［26］研究發(fā)現(xiàn)，ig給予苦楝皮水煎劑0.2～0.6 g生藥·kg-1時(shí)，可引起小鼠流產(chǎn)，吸收胎率增加，并呈劑量依賴性，其作用機(jī)制為苦楝皮引起孕鼠子宮的白細(xì)胞介素2增多，白細(xì)胞介素4減少，引起F4/80+巨噬細(xì)胞的活化，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值上升，導(dǎo)致胚胎早期死亡。翟向和等［27］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠于GD7ig給予苦楝皮水煎液，每只小鼠0.5 g生藥即可誘發(fā)小鼠流產(chǎn)。上述研究結(jié)果表明，土荊皮和苦楝皮均具有明顯的抗早孕作用（早期胚胎發(fā)育毒性），但二者對(duì)大鼠的生育力、胚胎-胎仔發(fā)育毒性和圍生期毒性尚未可知，值得進(jìn)一步研究。

4.4.2胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究

有關(guān)雄黃生育力、早期胚胎毒性和圍生期毒性研究尚未見報(bào)道，但進(jìn)行了胚胎-胎仔發(fā)育毒性相關(guān)研究。吳文斌等［28］研究發(fā)現(xiàn)，妊娠大鼠于GD6～15連續(xù)ig給予雄黃43，85和170 mg·kg-1（為臨床用量的25，50和100倍），對(duì)母鼠體質(zhì)量和胚胎形成等均無明顯毒性，胎鼠外觀、內(nèi)臟和骨骼也未見明顯毒性，表明雄黃并不引起妊娠大鼠及胚胎-胎仔發(fā)育毒性。谷穎敏等［29］研究發(fā)現(xiàn)，孕大鼠于GD6～15ig給予雄黃125，250和550 mg·kg-1均未見明顯的母體毒性反應(yīng)，550 mg·kg-1組胎仔體質(zhì)量、尾長(zhǎng)和頂臀長(zhǎng)減少，其他觀察指標(biāo)未見明顯影響；孕兔于GD6～15ig給予雄黃31，63 和125 mg·kg-1，3個(gè)劑量組母體子宮連胎質(zhì)量、子宮凈質(zhì)量、胎仔總質(zhì)量、胎盤總質(zhì)量、活胎率、胎仔體質(zhì)量、尾長(zhǎng)和頂臀長(zhǎng)均隨著雄黃劑量的增加而降低，63和125 mg·kg-1組活胎率明顯降低，但胎仔未見明顯畸形。上述研究結(jié)果均表明，雄黃未見明顯的致畸作用，但對(duì)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的毒性作用，且兔的敏感性高于大鼠。

上述3項(xiàng)研究為典型的大鼠和兔Ⅱ段生殖毒性研究，研究結(jié)果獲得了胚胎、胎仔發(fā)育毒性的NOAEL，對(duì)雄黃的臨床應(yīng)用具有明確的指導(dǎo)價(jià)值。

5 “小毒”藥材與飲片的生殖毒性研究

5.1 川楝子

川楝子具有疏肝泄熱、行氣止痛、殺蟲等功效，化學(xué)成分主要有川楝素和阿魏酸等，其生殖毒性研究報(bào)道較少，僅部分學(xué)者對(duì)川楝素進(jìn)行了抗早孕及其機(jī)制研究。張建樓等［26］研究發(fā)現(xiàn)，川楝素以小鼠LD50劑量的 1/60，1/30，1/20和1/15于GD5～7ip給予小鼠，各組流產(chǎn)率和吸收胎率均明顯升高。張先福［30］研究發(fā)現(xiàn)，川楝子的主要成分川楝素每只小鼠20 μg即可引起妊娠早期小鼠胚胎異常；川楝素每只小鼠30 μg可引起妊娠小鼠著床后全部流產(chǎn)、死亡或溶解。但對(duì)母體未見任何中毒癥狀，內(nèi)臟器官病變輕微，呈可逆性變化，表明妊娠早期ip給予川楝素對(duì)孕鼠具有胚胎毒性。進(jìn)一步研究表明，子宮局部CD4+和CD8+T細(xì)胞增多，Th1細(xì)胞因子TNF-α增多，Th2細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10減少，這可能與其致小鼠早期胚胎死亡毒性有關(guān)。

5.2 水蛭

水蛭，俗名螞蟥，具有活血、散瘀、通經(jīng)等功效，僅沈康等［31］對(duì)其進(jìn)行了胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠于GD7～11ig給予水蛭0.5和1.0 g生藥·kg-1，胎鼠體質(zhì)量下降，死胎、吸收胎和畸胎數(shù)明顯升高。

5.3 飛揚(yáng)草

飛揚(yáng)草具有清熱解毒、利濕止癢、通乳等功效，臨床主要用于肺癰、乳癰、疔瘡腫毒等疾病。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，僅Adedapo等［32］對(duì)其進(jìn)行了雄性小鼠生殖器官毒性研究。發(fā)現(xiàn)飛揚(yáng)草水提物在劑量為0.4 g生藥·kg-1時(shí)連續(xù)給藥14 d對(duì)小鼠睪丸及附屬器官具有毒性作用，提示其可能具有生殖毒性。

5.4 艾葉

艾葉具有溫經(jīng)止血、散寒止痛等功效，臨床主要用于吐血、衄血、崩漏、月經(jīng)過多和胎漏下血等病癥。僅蘭美兵等［33］對(duì)其進(jìn)行了胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究，發(fā)現(xiàn)于GD12～16ig給予艾葉揮發(fā)油（0.5，1.0和2.0 mL·kg-1），對(duì)胎仔均未見明顯致畸作用。

5.5 鴉膽子

鴉膽子具有清熱解毒、截瘧、止痢等功效，化學(xué)成分主要有鴉膽子苦醇和鴉膽子素等，臨床主要用于抗瘧疾和抗阿米巴原蟲，近年來也有用于抗腫瘤的報(bào)道。林瑩等［34］通過體外胚胎的方法觀察了鴉膽子苦醇對(duì)胚胎發(fā)育的影響。研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子的主要成分鴉膽子苦醇0.104，0.260，0.520和1.040 g·L-1添加到體外胚胎，觀察對(duì)胚胎形成的2-細(xì)胞期、4-細(xì)胞期、桑葚胚期和囊胚期4個(gè)時(shí)期的作用。結(jié)果表明，在4-細(xì)胞期，鴉膽子苦醇0.104，0.260和0.520 g·L-1組發(fā)育率顯著降低。0.104 g·L-1組囊胚發(fā)育率未見明顯變化，0.260 g·L-1組囊胚發(fā)育率顯著降低，1.040 g·L-1組無胚胎發(fā)育到4-細(xì)胞期和囊葚胚期，表明鴉膽子苦醇具有抑制胚胎早期發(fā)育的毒性作用。

5.6 重樓

重樓具有清熱解毒、消腫止痛等功效，化學(xué)成分主要有偏諾皂苷和薯蕷皂苷等，臨床常用于疔瘡癰腫、咽喉腫痛、蛇蟲咬傷和跌撲傷痛等病癥。沈放等［35］通過體外孵育的精子考察了其對(duì)精子活力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，重樓分離純化獲得的偏諾皂苷和薯蕷皂苷在體外均能明顯降低小鼠精子的活力，薯蕷皂苷在終濃度為40 mg·L-1時(shí)可殺滅全部精子，而偏諾皂苷在同樣濃度下還有部分精子存活。表明云南重樓對(duì)雄性動(dòng)物的生育力可能具有毒性作用。

已報(bào)道的“小毒”類中藥材均未按照國(guó)際國(guó)內(nèi)相關(guān)指導(dǎo)原則進(jìn)行系統(tǒng)的生殖毒性研究，多數(shù)研究結(jié)果為生殖器官毒性研究，僅能提示其可能具有生殖毒性的風(fēng)險(xiǎn)，未能準(zhǔn)確區(qū)分生殖毒性的種類和強(qiáng)度（如生育力毒性、早期胚胎發(fā)育毒性、胎仔發(fā)育毒性、圍生期毒性和母體毒性等），對(duì)該類藥物臨床應(yīng)用的指導(dǎo)作用有限，尚需進(jìn)一步研究。

7 結(jié)語與展望

受限于“中藥無毒”的理念，多數(shù)患者在服用中藥制劑后只有在毒性反應(yīng)很嚴(yán)重時(shí)才會(huì)就診就醫(yī)，對(duì)于輕微的毒性反應(yīng)患者往往容易忽視。因此，很多中藥的毒性反應(yīng)未能很好地記錄。明太醫(yī)劉純?cè)凇端幹瓮ǚㄑa(bǔ)遺》中寫到“是藥三分毒”，可見古代醫(yī)家也并非認(rèn)為所有的中藥均是無毒的。如金元大家張?jiān)卣J(rèn)為“半夏動(dòng)胎”，即半夏可引發(fā)先兆流產(chǎn)或流產(chǎn)，現(xiàn)代研究也證明了半夏在這方面的作用。然而，目前中藥安全性的數(shù)據(jù)特別是毒性中藥材的生殖毒性數(shù)據(jù)還非常匱乏，《藥典》中記載的毒性中藥材僅20種進(jìn)行了部分生殖毒性研究，在該方面研究多數(shù)尚屬空白，這給臨床患者用藥帶來潛在的風(fēng)險(xiǎn)。

通過對(duì)毒性中藥材生殖毒性研究文獻(xiàn)的總結(jié)和分析，發(fā)現(xiàn)已有的毒性中藥材的生殖毒性研究還存在較多問題。主要是缺乏系統(tǒng)性，多數(shù)生殖毒性研究不完整，僅通過體內(nèi)和（或）體外試驗(yàn)進(jìn)行了某一部分的生殖毒性研究，未進(jìn)行系統(tǒng)研究，如基本無圍生期毒性研究，對(duì)生育力毒性的研究報(bào)道也較少。其次，是使用未進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證的生殖毒性替代方法進(jìn)行相關(guān)研究，研究結(jié)果的可重復(fù)性可能會(huì)受到一定的影響。

由于中國(guó)已經(jīng)正式加入人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（International Council for Harmoniza?tion，ICH），毒性中藥材生殖毒性的研究除遵守我國(guó)相關(guān)的法律法規(guī)之外，還應(yīng)遵循ICH生殖毒性相關(guān)的指導(dǎo)原則（M3和S5）。在進(jìn)行毒性中藥材生殖毒性研究時(shí)，根據(jù)中藥材的臨床適應(yīng)證、擬用人群、已知的毒性靶器官或毒理學(xué)參數(shù)等特點(diǎn)，可采用全段式或分段組合式（Ⅰ和Ⅱ段組合或Ⅱ和Ⅲ段組合）生殖毒性設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)研究結(jié)果為陰性時(shí)，可免做分段試驗(yàn)。該設(shè)計(jì)可降低多數(shù)無生殖毒性和（或）生殖毒性較低中藥材的研發(fā)成本，并縮短研發(fā)時(shí)間。而對(duì)于已有文獻(xiàn)報(bào)道可能具有生殖毒性的中藥材或前述全段式和（或）分段組合式生殖毒性試驗(yàn)出現(xiàn)陽性結(jié)果時(shí)，則需采用分段式生殖毒性設(shè)計(jì)，詳細(xì)考察其生殖毒性，必要時(shí)進(jìn)行生殖毒性伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究。

此外，經(jīng)過驗(yàn)證的體外生殖毒性替代試驗(yàn)系統(tǒng)是國(guó)外興起的一種新的生殖毒性評(píng)價(jià)系統(tǒng)，如體外全胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)、胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)試驗(yàn)和胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)。該系統(tǒng)雖然不能完全代替體內(nèi)生殖毒性試驗(yàn)，但可起到早期預(yù)警作用，且研發(fā)投入相對(duì)較小，研發(fā)時(shí)間較短。進(jìn)行毒性中藥材生殖毒性研究的機(jī)構(gòu)或個(gè)人，可根據(jù)中藥材的實(shí)際情況，在進(jìn)行全面的生殖毒性研究之前先通過體外生殖毒性替代方法進(jìn)行預(yù)研究，為后續(xù)的生殖毒性研究設(shè)計(jì)提供更多的信息。