植物miRNA在中藥物質基礎研究中的應用

中央民族大學藥學院，北京 100081

中藥物質基礎研究是闡明中藥的藥效物質、藥理活性、作用機制和臨床療效的先決條件，也是直接影響中藥單味藥物和復方制劑開發(fā)、藥物炮制工藝、劑型改進和質量標準制定的重要基礎，也是中藥現(xiàn)代化的重要研究內容和組成部分。中藥物質基礎和藥效的研究已經有近80年的歷史，目前，中藥單味藥和復方的藥效物質基礎研究成為國內外學者的研究熱點，并且取得了很大的成就，如我國著名中藥研究者屠呦呦從中藥青蒿中提取到抗瘧疾作用成分青蒿素，并獲得了2015年的諾貝爾生理或醫(yī)學獎，研究者在青蒿素的基礎之上合成雙氫青蒿素等近百種青蒿素衍生物，治療和挽救了無數瘧疾患者的生命[1]。

中藥中含有的有效成分具有種類多，結構復雜，同時相互之間又有協(xié)同或拮抗作用，構成中藥的多成分、多途徑、多靶點的復雜體系，給中藥的藥效物質基礎研究帶來了巨大的困難和挑戰(zhàn)。再加上中藥物質基礎研究濃厚的化學背景，從而促使大部分研究者把目光集中在對黃酮、皂苷等次級代謝產物的研究上，而忽略了對核酸、蛋白質等初級代謝產物作用的研究。雖然初級代謝產物大多為大分子物質，在消化道中被分解成為最小的基本單位被集體吸收利用，但部分小分子初級代謝產物可以以整體性形式被穩(wěn)定地吸收進入體內并發(fā)揮其藥理作用，這給中藥的物質基礎研究提供了新的研究思路和方法。

1 中藥物質基礎研究存在的問題

中藥物質基礎的研究思路與方法源于西方重視因果關系的哲學思想體系和對于植物化學研究，即對中藥中有效成分進行提取、分離、結構鑒定、活性篩選等步驟進行物質基礎研究以闡明其作用。中藥研究采取此類研究方法對中藥的化學成分和生物活性進行研究，揭示了一大批中藥的物質基礎，取得了重要的研究成果，如中國中醫(yī)科學院的屠呦呦教授等發(fā)現(xiàn)青蒿素是青蒿中抗瘧的主要有效成分、北京協(xié)和醫(yī)學院陳克恢教授發(fā)現(xiàn)麻黃堿是麻黃利尿調節(jié)血壓的主要有效成分[1-2]。目前對于中藥物質基礎研究主要集中于中藥的次級代謝產物，雖然能夠在很大程度上說明大部分中藥的藥物作用基礎，但是僅從次級代謝產物藥理作用分析的角度仍然難以對部分中藥的藥物作用物質基礎進行合理解釋。

目前大部分的研究集中于在次級代謝產物，對于初級代謝產物是否為中藥作用物質基礎的問題成為了研究的新方向。從生物化學的角度來看，外源性的蛋白質、脂質、核酸等初級代謝產物進入消化道后均被降解成為最基本的氨基酸、甘油、核苷酸等最小單位被吸入體內，如核酸的分解過程：外源性的核酸物質在生物體內在多種酶的催化下，水解生成核苷等小分子物質被吸收[3]，導致普遍認為蛋白質、脂質和核酸經消化吸收后就失去其生物活性。現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)外源性的植物miRNA可在人體內穩(wěn)定存在，部分研究還發(fā)現(xiàn)一些中藥的miRNA存在一定的藥理活性。中藥所含的植物miRNA是否是中藥藥物作用的物質基礎，成為新的中藥物質基礎研究關注點[4-6]。

2 miRNA在人體內的存在

微小RNA(microRNA，miRNA)是由真核生物內源性發(fā)夾結構轉錄產物衍生而來的一種長19～25nt的單鏈RNA。miRNA可作為一種引導性分子通過堿基配對與靶mRNA結合從而在轉錄后引起靶mRNA的剪切或翻譯的抑制，從而影響蛋白質的表達。研究表明，miRNA在不同調節(jié)途徑中發(fā)揮關鍵作用，包括造血細胞的分化、細胞凋亡、細胞增殖以及腫瘤的形成等方面[7]，并發(fā)現(xiàn)miRNA與RNA病毒和DNA病毒在致病性及病毒與宿主的相互作用方面具有一定的作用[8-9]。目前對于miRNA的具體作用機制尚不清楚，主要由于miRNA與其靶mRNA形成一種復雜的作用網絡。例如，一種miRNA可以結合并調節(jié)多種mRNA，與此同時，一個mRNA可與多個miRNA結合，故其作用機制復雜多樣。miRNA的具體作用機制仍然是一個待解決的科學難題，對于miRNA的調節(jié)作用網絡的研究尚處于起步狀態(tài)。

外源性植物miRNA可以直接被哺乳動物從食物中吸收，并且在血漿和組織之中。Lin Zhang等在利用Solexesa測序法發(fā)現(xiàn)中國人的血漿中發(fā)現(xiàn)了十字花科植物的miRNA---MIR156a和MIR168a的存在，推測與中國人以水稻為主食的飲食習慣有關。實驗利用RT-PCR和Northern Blotting技術對于這兩種外源性植物miRNA的含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)這兩種外源性植物miRNA在人體血液中濃度很高，利用高碘酸對于血液中的外源性植物miRNA進行了進一步的處理測定，進一步驗證了這兩種miRNA在人體體內的存在。進一步研究miRNA的吸收過程，發(fā)現(xiàn)了miRNA是以整體形式通過被囊泡包裹吸收的形式經小腸吸收如體內[6]。Jonathan W. Snow等[10]進一步驗證了外源性植物miRNA通過腸胃吸收進入人體，并以不同濃度存在于各個器官之中。Anna Lukasik等[11]發(fā)現(xiàn)在人類樣本中的高豐度水平的MIR168a等基因，可以通過血乳屏障在豬的母乳中檢測，并確定了其通過量的最大值。這些人體對于外源性植物miRNA吸收分布的研究為中藥miRNA作為中藥作用有效物質進入體內發(fā)揮藥物作用的研究奠定了基礎。

3 外源性中藥miRNA的藥理作用

甘草具有調節(jié)免疫等作用，能調和百藥解百毒，更有“國老”之稱、“十方九草”之說。目前對于甘草的增強免疫力作用效果的物質基礎及其作用機制尚不清楚。邵紅偉等[5]利用植物miRNA提取試劑盒從甘草水提物凍干粉中提取并純化獲得甘草miRNA，利用所提取的甘草miRNA作用于健康人血中分離的外周血單核細胞(PBMC)，從細胞形態(tài)變化、細胞數量鑒定細胞的增值情況以反應甘草miRNA對免疫細胞的影響。對比了甘草miRNA與甘草水提物、甘草酸、甘草次酸的對PBMC的影響結果表明，甘草miRNA組PMBC細胞出現(xiàn)明顯的抱團現(xiàn)象，且抱團數量明顯增多，證明了甘草miRNA對于PBMC的促進作用，為解釋甘草的調節(jié)機體免疫功能的藥效物質基礎研究提供了新的證據。

向靜等[12]利用從甘草水煎劑中提取的miRNA以及合成的甘草miRNA模擬物作用于PBMC，再一次證實甘草miRNA具有明顯的免疫調節(jié)功能，并利用RT-PCR對其模式識別受體(PRR) 基因以及部分轉錄因子、信號分子和細胞因子的基因表達變化進行分析。結果表明，甘草miRNA對免疫細胞表面的一類模式識別受體TLR家族中的TLR1、TLR9表達上調作用，對TLR4和TLR8的表達則有下調的作用。甘草miRNA能夠使得AP-1的重要組分c-JUN和c-FOS表達下降，說明其通過抑制AP-1通路來抑制Th2細胞分化。甘草miRNA還降低了NF-kB，p53和STAT1的表達，說明其可能抑制了炎癥通路、凋亡以及Th1細胞的分化。值得關注的是，促炎因子IL-6的表達在miRNA組和總提物組相反，說明甘草水煎劑中成分和作用的復雜性，其整體作用效果可能是是由甘草miRNA與甘草所含次級代謝產物共同作用產生的。

金銀花具有良好的清熱解毒作用，廣泛應用于各種病毒性感冒，但目前基于金銀花抗病毒作用的次級代謝產物成分藥效物質基礎研究難以說明金銀花的抗病毒作用。Zhen Zhou等[6]利用金銀花水煎液中提取的miRNA2911分別進行體內和體外的抗病毒實驗，發(fā)現(xiàn)其對于流感A類病毒具有廣譜抗流感病毒作用，特別是H1N1、H5N1和H7N9病毒。該研究首先證明了miRNA2911能在金銀花水煎液中穩(wěn)定存在，并能夠被人體吸收。根據金銀花中miRNA2911的序列進行人工合成，利用合成的miRNA2911提取物對小鼠進行灌胃實驗，在外周血及肺部中都能顯著發(fā)現(xiàn)miRNA2911的存在，并利用無效的miRNA2911類似序列核苷酸進行抗病毒實驗，發(fā)現(xiàn)其可以在體內檢測到，但是無抗病毒效果。隨后利用抗miRNA2911的核苷酸序列與miRNA2911同時灌胃，也無抗病毒效果。該研究直接證明了金銀花的抗病毒作用的物質基礎之一是其含有的miRNA2911。

4 討論

中藥miRNA的相關研究給中藥作用物質基礎研究提供了一個新的研究思路，藥物的作用物質基礎不僅僅局限于次級代謝產物也可能是核酸等初級代謝產物，這為中藥的質量控制、新藥開發(fā)等提供了一個新的研究方向。在中藥作用物質基礎研究方面，很多中藥的次級代謝產物的體內體外實驗都難以說明某些藥物作用，如金銀花的抗病毒作用等。這類問題可以嘗試從miRNA的角度去建立研究方法。在藥物開發(fā)上，如果發(fā)現(xiàn)某個中藥的藥效作用的有效成分是miRNA，則可以嘗試使用PCR技術對于相應的miRNA片段進行擴增或者人工合成，制成注射劑、片劑等生物制劑，使得中藥的衍生產品更加豐富，患者用藥更加方便，藥物生產效率，降低成本。在某些中藥質量控制和藥物炮制過程中，miRNA的種類和含量的改變同樣值得關注。

雖然miRNA作為中藥物質基礎研究的前景十分可觀，但是對于其后續(xù)的開發(fā)應用方面所涉及的問題仍然值得思考。miRNA的具體作用機制尚不完全清楚，其開發(fā)應用方面也必然會受到一定的限制。首先，中藥所含的miRNA雖然被證明是中藥藥效作用的物質基礎，但是miRNA本身是一種核酸，其制劑開發(fā)應用就會從中藥資源開發(fā)轉變成為基因治療藥物開發(fā)，不可避免會涉及基因治療的倫理問題，必須衡量其實用性和風險性。其次，在應用的技術問題上，也存在許多問題，如目的基因表達可控性差、miRNA多靶點引起的副作用、使用劑量的考核、人體排出體外和體內積累等問題，其中最令人擔憂的是長期安全性和耐藥性的產生。

隨著技術水平的不斷提高，新發(fā)現(xiàn)和新理論的提出，都進一步深化了中藥物質基礎研究，但是目前面臨的待解決的問題仍然很多。例如文章提出的“miRNA可能是中藥藥物作用新機制”的觀點仍需要更多的實驗研究證明，其后續(xù)相關研究仍有很多問題亟待解決，中藥作用的物質基礎仍需最大限度地運用現(xiàn)代相關技術進一步分析。

[1]蘇新專, H. ML, 李劍.青蒿素的發(fā)現(xiàn)與諾貝爾生理學或醫(yī)學獎 [J]. 中國科學：生命科學, 2015, 45(11): 1148-1152.

[2]張均田.中國建國50年中藥化學與藥理研究的主要成就和面臨的問題及對策 [J]. 中國中藥雜志, 2000, 25(7): 387-390.

[3]王鏡巖,朱圣庚,徐長法.生物化學 [M].3版.北京：高等教育出版社, 2011.

[4]Zhang L, Hou D, Chen X, et al. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA [J]. Cell Res, 2012, 22(1): 107-26.

[5]邵紅偉, 何免, 陳嘉斯, 等. 甘草水煎劑中miRNA的提取及其對人外周血單個核細胞的影響研究 [J]. 中藥材, 2015, 38(7): 1449-1453.

[6]Zhou Z, Li X, Liu J, et al. Honeysuckle-encoded atypical microRNA2911 directly targets influenza A viruses [J]. Cell Res, 2015, 25(1): 39-49.

[7]Zhang B, Pan X, Cobb GP, et al. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors [J]. Dev Biol, 2007, 302(1): 1-12.

[8]Pfeffer S, Zavolan M, Grasser FA, et al. Identification of virus-encoded microRNAs [J]. Science, 2004, 304(5671): 734-6.

[9]Swaminathan G, Martin-Garcia J, Navas-Martin S. RNA viruses and microRNAs: challenging discoveries for the 21st century [J]. Physiol Genomics, 2013, 45(22): 1035-48.

[10]Snow JW, Hale AE, Isaacs SK, et al. Ineffective delivery of diet-derived microRNAs to recipient animal organisms [J]. RNA Biol, 2013, 10(7): 1107-16.

[11]Lukasik A, Zielenkiewicz P. In silico identification of plant miRNAs in mammalian breast milk exosomes--a small step forward [J]. PLoS One, 2014, 9(6): e99963.

[12]向靜, 黃潔嫦, 徐暢, 等. 甘草水提物中miRNA對人免疫細胞基因表達的影響 [J]. 中國中藥雜志, 2017, 42(9): 1752-1756.