孕牛血清早孕因子的研究進(jìn)展

王曉姍

(甘肅省臨澤縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，甘肅臨澤 734200)

早孕因子( early pregnancy factor，EPF)是1974年由澳大利亞學(xué)者M(jìn)orton等，在孕鼠血清中首次發(fā)現(xiàn)[1]，它不但是一種妊娠相關(guān)的蛋白，而且還有其它很廣泛的作用。如在超早期妊娠診斷中的應(yīng)用、檢測胚胎的成活情況、檢測妊娠中斷、分析不孕情況、腫瘤診斷和治療方面的應(yīng)用等方面的作用[2]，具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 EPF的分泌來源及存在形式

1974 年Morton首次從孕鼠血清中發(fā)現(xiàn)EPF活性,之后世界各國的學(xué)者分別從妊娠婦女 、牛、羊、豬等妊娠動(dòng)物母體血清中檢測到了EPF 活性因子[3]，此后專家學(xué)者進(jìn)一步分別在孕婦子宮頸黏液、男性睪丸惡性生殖細(xì)胞腫瘤患者血清、絨癌患者血清中檢出EPF樣活性[4]；Ito 等在牛胚胎培養(yǎng)液、懷孕婦女的尿液、羊胎盤提取物及老鼠卵巢和輸卵管培養(yǎng)基等中也檢測到了EPF 活性[5]；在胎牛、小牛、動(dòng)情期牛及妊娠期牛血清與體外受精的牛卵細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)受精卵細(xì)胞也有EPF活性；在妊娠期間淋巴細(xì)胞內(nèi)蛋白合成增加，檢測發(fā)現(xiàn)有一種具有EPF活性的分子，但更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EPF主要是由卵巢和胚胎分泌產(chǎn)生。早期孕絨毛組織也可產(chǎn)生EPF，但絨毛組織產(chǎn)生的胎源性EPF與母源性EPF不完全相同，主要在表現(xiàn)花環(huán)抑制活性方面，即母源性EPF是在抑制因子參與下表現(xiàn)活性的，但是絨毛組織產(chǎn)生的EPF在無血清條件下也可表現(xiàn)花環(huán)抑制活性[7]。再者證實(shí)EPF的合成起始主要依賴于一個(gè)合適的激素環(huán)境，但關(guān)于EPF的分泌機(jī)制有很多不同的說法，而普遍認(rèn)為EPF的產(chǎn)生與卵巢、輸卵管、受精卵、胎盤、垂體等有關(guān)。

早孕因子在附植前有兩種形式：早期的EPF是在著床前和著床期間由母體分泌的, 并且在著床前有兩種形式為EPF-A和EPF-B[8]。EPF-A是由受精卵產(chǎn)生,EPF-B是妊娠依賴性的，由卵巢釋放，是卵因子，即卵巢對(duì)垂體催乳素及精子穿透卵子時(shí)孕卵發(fā)出信號(hào)的反應(yīng)，亦即受精卵產(chǎn)生了EPDB釋放因子而非EPF-B本身，晚期的EPF是著床后由胚胎分泌的。

2 EPF本質(zhì)及其特性

EPF是一種糖蛋白，耐透析、對(duì)溫度、酸堿度的耐受性較強(qiáng)，溫度<56℃時(shí)比較穩(wěn)定，但是一旦超過72℃時(shí)則容易失活。目前來看，主要還是通過提純的辦法獲取EPF，不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同物種在不同孕期用不同方法分離提取的EPF，分子量都不同，在血液中提純的EPF分子質(zhì)量范圍為10～450 ku不等[9]。其原因推測可能是發(fā)生某種聯(lián)系，形成二聚體和三聚體等自聚形式，或者也可能攜帶載體蛋白，其分子存在形式較復(fù)雜，但聚合體究竟是純化過程中形成，還是體內(nèi)本身就存在，目前尚未見到詳細(xì)的報(bào)道，但其基本的活性成分都是由102氨基酸殘基構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn)豬和牛的氨基酸序列完全相同[10]，分子質(zhì)量均為10.93 ku ，等電點(diǎn)約為6.5，小鼠和人的EPF氨基酸序列純合度為97%[11]，分子質(zhì)量為10.96 ku，等電點(diǎn)約為6.8。EPF屬于一個(gè)大的基因家族成員，它與細(xì)胞內(nèi)蛋白- 細(xì)胞伴侶蛋白10(Cpn10)(熱休克蛋白家族)高度同源[12]，但證實(shí)Cpnl0和EPF在作用機(jī)理上存在差別，主要表現(xiàn)在，Cpn10是在細(xì)胞內(nèi)與Cpn60特異性結(jié)結(jié)合，并且輔助蛋白質(zhì)正確折疊，然而EPF作為胞外蛋白發(fā)揮作用[13]，由此推測 Cpn10 和EPF只是相同基因在不同時(shí)空下表達(dá)產(chǎn)生的兩種作用完全不同的蛋白。有人發(fā)現(xiàn)EPF分子的N末端必須變構(gòu)(乙?；蛱砑影被?后才能發(fā)揮作用，而Cpn10功能發(fā)揮方面則不需要此變化，也有人發(fā)現(xiàn)人第1和第16染色體上有一段表達(dá)EPF/cpn10的無內(nèi)含子的基因序列，并且有研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)于8條染色體上的9個(gè)不同位點(diǎn)[14]。目前通過蛋白酶解技術(shù)已破譯了70%的EPF氨基酸序列，EPF的活性分子基礎(chǔ)是硫氧還原蛋白(TRX) ,它發(fā)揮調(diào)節(jié)因子的作用[15]。

3 EPF的作用機(jī)制

3.1 免疫抑制作用

EPF是存在于正常妊娠血清中的一種溫和的、天然的免疫抑制物，妊娠初時(shí)母體沒有排斥特殊的外來物質(zhì)--胚胎，這是個(gè)復(fù)雜的母胎免疫耐受調(diào)節(jié)過程，主要抑制T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能[16]，表現(xiàn)在T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng) 反應(yīng)方面，EPF結(jié)合在淋巴細(xì)胞上，刺激其產(chǎn)生一些可溶性抑制因子抑制淋巴細(xì)胞DNA的合成，并呈一定劑量依賴性[17]，另外就是抑制有絲分裂原刺激的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)[18]。

EPF主要是調(diào)節(jié)CD4T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)作用的，抗CD4能抑制綿羊紅細(xì)胞和其在T細(xì)胞上受體的相互作用[19]，十幾年來，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)早孕因子可從各個(gè)階段抑制T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的反應(yīng)。淋巴細(xì)胞失去了協(xié)同刺激信號(hào)---一些粘附分子，如細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)[20]，影響了淋巴細(xì)胞的活化和增殖，這也是運(yùn)用玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)檢測EPF活性的原因。

3.2 生長調(diào)節(jié)作用

研究發(fā)現(xiàn)EPF還具有生長因子調(diào)節(jié)作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長，其作用不具有特異性，這種作用是在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的[21]。在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了EPF,與細(xì)胞生長有關(guān)，并且細(xì)胞進(jìn)入分化階段時(shí)，分泌產(chǎn)生的EPF明顯減少，若將腫瘤細(xì)胞和EPF單克隆抗體一起培養(yǎng)時(shí)，腫瘤細(xì)胞的成活率會(huì)隨著抗體濃度的增多而減少[22]。由此可知腫瘤的發(fā)生是由EPF免疫抑制和生長調(diào)節(jié)活性功能共同所致，況且，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)EPF還能促進(jìn)受精胚胎的生長發(fā)育，以及對(duì)其進(jìn)行一定的修復(fù)損傷[23]，因此EPF 的免疫抑制和生長調(diào)節(jié)活性在保證胚胎生長發(fā)育方面起著相當(dāng)重要的作用。在肝細(xì)胞增生期間，EPF能夠促進(jìn)DNA合成和細(xì)胞分裂，由這些證據(jù)推測，EPF有可能是通過自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生的一種生長因子來參與正常細(xì)胞的增殖過程[24]，但是,有關(guān)其發(fā)揮調(diào)節(jié)生長功能機(jī)制還需進(jìn)一步研究探討。

4 早孕因子的應(yīng)用

4.1 在超早期妊娠診斷中的應(yīng)用

目前，EPF是最早確認(rèn)妊娠的生化指標(biāo)之一。由于其可以在妊娠母體內(nèi)最早檢測到，并且具有很高的特異性，先比在懷孕大概第八天后HCG才可檢測到而言，EPF作用更大，并且EPF在妊娠結(jié)束前才消失[25]，因此EPF臨床應(yīng)用方面引起了人們極大的關(guān)注。在小鼠受精后6 h，兔受精后16 h，大鼠、綿羊、牛、豬受精后24h，人受精后48 h ，即可在其血清中檢測到EPF活性，并且在小鼠體內(nèi)EPF的存在可持續(xù)至分娩前4d ,綿羊、豬體內(nèi)幾乎都持續(xù)整個(gè)孕期[27]，若一旦妊娠終止，血清中EPF 立即消失。EPF作為超早孕診斷指標(biāo)，在孕婦血液中的檢測準(zhǔn)確率達(dá)可達(dá)88.6%，有研究發(fā)現(xiàn)EPF也可應(yīng)用于育齡婦女的催經(jīng)止孕，減少患者的心理顧慮。因此，EPF對(duì)人以及動(dòng)物的超早期妊娠診斷有著重大的意義。

4.2 檢測胚胎的成活情況

EPF的免疫調(diào)節(jié)作用在一定程度上決定了胎兒在母體內(nèi)不被當(dāng)作外來物質(zhì)而受到免疫排斥，運(yùn)用血清中EPF的RIT值來預(yù)測胚胎的形成及生長狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎移植12 h，血清中即可出現(xiàn)EPF，在胚胎死亡或胚胎取出24～48 h內(nèi)[29]，EPF隨即消失，依據(jù)此狀況，可用RIT檢測體外胚胎的成活狀況。在胚胎監(jiān)控方面，通過監(jiān)測孕畜血清中的EPF水平來判斷孕畜是否流產(chǎn)、檢測胚胎移植是否失敗，監(jiān)測妊娠母體的胎兒狀態(tài)等。實(shí)驗(yàn)中，通過監(jiān)測流產(chǎn)婦女在3～7 d內(nèi)血清中EPF含量的變化，發(fā)現(xiàn)EPF呈下降趨勢[30]，EPF消失說明EPF與胚胎的生長情況密切相關(guān)。在胚胎生長1～2個(gè)細(xì)胞到近著床期間，EPF對(duì)胚胎還起著的支持生長的作用。

4.3 檢測妊娠中斷

EPF是妊娠依賴性的，精子穿透卵子形成受精卵后，受精卵開始分泌卵因子，也叫早孕因子釋放因子，該因子促使卵巢分泌EPF[31]，其分泌量與早孕因子釋放因子的分泌量呈正相關(guān)，當(dāng)孕畜自然流產(chǎn)和胚胎死亡或人工流產(chǎn)后，EPF分泌量都會(huì)下降。在母體懷孕期間，EPF在動(dòng)物體內(nèi)都發(fā)生生物活性作用，因此測定EPF活性可作為妊娠是否繼續(xù)維持的重要指標(biāo)。

4.4 分析不孕情況

長期以來，發(fā)現(xiàn)奶牛屢配不孕現(xiàn)象是很常見的，因此通過測定體內(nèi)EPF活性，來探討是否母牛是由于產(chǎn)生抗精子性不孕，還是早期胚胎的死亡造成的不孕。如果在奶牛為異常疾病情況下，正常配種后未監(jiān)測到EPF活性，可以認(rèn)為是受精障礙所導(dǎo)致；若受精后數(shù)日內(nèi)EPF升高，但最終未懷孕者，可推測是已經(jīng)發(fā)生了胚胎死亡。

4.5 腫瘤診斷和治療方面的應(yīng)用

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，在懷孕母體血清中發(fā)現(xiàn)有EPF活性外，在腫瘤患者血清中也發(fā)現(xiàn)有EPF，并且診斷惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤準(zhǔn)確率已達(dá)91.3%[32]。此外，治療前后惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者，抗體滴度差異較大，因此，監(jiān)測患者體內(nèi)EPF含量可作為診斷母細(xì)胞瘤的一種血清學(xué)指標(biāo)，對(duì)其預(yù)后判斷意義很大，同時(shí)EPF還可以監(jiān)測患者體內(nèi)是良性還是惡性的滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤也有一定意義[33]。研究發(fā)現(xiàn)，EPF存在可使機(jī)體更易接受腫瘤細(xì)胞，因此，我們由此判定，EPF的拮抗劑將有有益的治療效果。孕血清中的EPF與腫瘤患者血清中的腫瘤源性EPF(t-EPF)都具有類似的分子構(gòu)型和交叉免疫反應(yīng)，因此,從孕血清中分離純化的EPF抗原所制備的單克隆抗體,來測定腫瘤患者血清中的(t-EPF)，從理論上講是可行的，有待進(jìn)一步的研究。如果能夠成功制作EPF單克隆抗體，酶或熒光標(biāo)記后，制作靶向藥物，在EPF單抗上攜帶藥物，在細(xì)胞大量增生處，直接到達(dá)病灶來殺死惡性腫瘤細(xì)胞。

5 其他方面的應(yīng)用

抗精子抗體是機(jī)體產(chǎn)生的，與精子表面抗原特異性結(jié)合，具有凝集精子、抑制精子從宮頸黏液向?qū)m腔內(nèi)移動(dòng)，是引起動(dòng)物免疫性繁殖障礙的最常見原因。EPF是一種妊娠相關(guān)蛋白，也是免疫抑制物，可抑制T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，而抗精子抗體性主要也是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，因此，EPF在治療人和動(dòng)物的繁殖免疫性疾病有著重要意義。研究還發(fā)現(xiàn)，EPF能夠預(yù)防器官移植后的排斥反應(yīng)[34]，可延長移植皮膚的存活時(shí)間,也可治療燒傷、潰瘍、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。