羊肚菌白霉病病原菌及病害樣地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)研究*

李建英，華 蓉，孫達鋒，，溫憲勤，李雪松，馬 明，高章會，和 勇，劉紹雄，**

（1．中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2．云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南 昆明 650221；3．云南省種子管理站，云南 昆明 650031）

羊肚菌（Morchella spp．）又名蜂窩菌、羊肚菜、羊肚蘑、苞谷菌等，分類學上隸屬于子囊菌門（Ascomycota）盤菌綱（Pezizomycetes）盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae），是羊肚菌屬（Morchella）真菌的統(tǒng)稱[1]。羊肚菌味道鮮美，富含蛋白質(zhì)、維生素和多種礦物質(zhì)，氨基酸種類齊全、不飽和脂肪酸比例高，還含有多糖、多酚、蛋白水解物、γ-氨基丁酸、甾醇、呋喃化合物等多種生物活性物質(zhì)[2-3]。大量研究結(jié)果表明，羊肚菌具有調(diào)節(jié)機體免疫力、抗疲勞、抗氧化、保肝護肝等藥用功效，是世界四大名菌之一，市場需求量較大[4-14]。

我國從20世紀90年代開始研究羊肚菌人工栽培，隨著新品種選育和栽培技術(shù)的不斷創(chuàng)新，羊肚菌產(chǎn)業(yè)化栽培取得了重大突破，栽培產(chǎn)量顯著提高。據(jù)不完全統(tǒng)計，2020年～2021年，羊肚菌全國栽培面積已從9 333 hm2增加到10 667 hm2，是世界第一羊肚菌栽培大國[15]。然而，羊肚菌栽培的模式主要為季節(jié)性大棚栽培，在栽培過程中，受環(huán)境和人為因素雙重影響，隨著栽培年限增加，病蟲害問題日益凸顯。

截至2021年，云南省玉溪市，全市食用菌栽培面積達287 hm2，同比增長86．96%；總產(chǎn)量達2．5萬噸，食用菌產(chǎn)值達11．34億元。其中羊肚菌栽培面積達154 hm2，較2020年增長10倍，農(nóng)民總收入增加6 000萬元，每公頃平均產(chǎn)值達37．95萬元，成為云南省羊肚菌栽培面積增幅最大的市[16]。新平縣是玉溪市羊肚菌重點栽培縣，其中一個栽培基地發(fā)生了嚴重的白霉病，導致絕收。白霉病是目前羊肚菌栽培中較常見、危害較嚴重的一種病害，表現(xiàn)為羊肚菌子實體菌蓋、菌柄或整體感染白色絨毛狀菌絲[17]。根據(jù)研究報道，目前發(fā)現(xiàn)的白霉病病原菌有長毛擬青霉（Paecilomyces penicillatus）和曲霉（Aspergillus sp．）等[17-20]。

針對玉溪市新平縣羊肚菌絕收樣地，開展病害調(diào)查和病原菌研究，分析土壤真菌多樣性，研究本次羊肚菌嚴重病害的原因，以期為羊肚菌栽培管理和病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點調(diào)查和樣品采集

1．1．1 采樣點概況

以玉溪市新平縣內(nèi)羊肚菌病害嚴重導致絕收的區(qū)域作為本次羊肚菌病害調(diào)查和樣品采集地，該地位于 101°55′22″E，23°58′45″N，海拔（1 928．0 ±2．1）m。

1．1．2 病害調(diào)查和樣品采集

調(diào)查時間為2022年2月17日。采集具有典型病害特征的子實體和發(fā)病樣地的土壤樣品，詳細記錄采集地點、采集時間、病害發(fā)生時間及病害特征等信息，用冰盒保存樣品帶回實驗室進行病原菌分離鑒定，并開展土壤真菌群落結(jié)構(gòu)研究。

1.2 羊肚菌病原菌分離鑒定

結(jié)合病害調(diào)查情況，采用真菌分離鑒定方法對病原菌進行研究。

1．2．1 培養(yǎng)基制備

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀 1．0 g、硫酸鎂 0．5 g、氯霉素 0．1 g、瓊脂15 g～20 g，1/3 000孟加拉紅溶液100 mL，蒸餾水1 000 mL。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g～20 g，蒸餾水 1 000 mL。

1．2．2 病原菌分離與純化

在超凈工作臺進行無菌操作，從染病的子實體上直接挑取霉菌菌絲，接種在孟加拉紅培養(yǎng)基上。置于24℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 d～5 d后，挑取少量菌落邊緣菌絲或帶菌絲的培養(yǎng)基至PDA培養(yǎng)基中進行純化。重復純化直至獲得單一菌落，于4℃～6℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 菌株鑒定

結(jié)合顯微形態(tài)和分子系統(tǒng)學確定病原菌分類學地位。

1）顯微形態(tài)鑒定

挑取子實體上的霉菌和純化后的病原菌，在電子顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子及厚垣孢子等的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2）分子系統(tǒng)學鑒定

采用rDNA ITS序列分析法進行分子系統(tǒng)學鑒定[21-23]，病原菌菌株樣品送至昆明碩擎生物科技有限公司進行DNA提取和測序。獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST序列比對，下載相似度較高的序列。使用MEGA 6軟件，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定病原菌菌株的系統(tǒng)學分類地位。

1.3 發(fā)病樣地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

按照試劑盒操作說明提取土壤樣品基因組DNA，完成提取后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA。使用Covaris M220隨機打斷DNA，后將樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司構(gòu)建測序文庫。文庫合格后進行測序，獲得數(shù)據(jù)后開展土壤樣品真菌群落結(jié)構(gòu)生物信息學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌病害調(diào)查

該樣地播種羊肚菌后74 d（即第1潮菇出菇期），澆水后通風不良，棚內(nèi)溫度升高，高溫高濕環(huán)境下，白霉病開始發(fā)生。幼菇先被感染，從菇腳往上通體長滿白色霉狀菌絲，后快速蔓延，呈現(xiàn)大面積病害，子實體變形、死亡，導致絕收。樣地子實體受害情況見圖1。

圖1 病害癥狀Fig．1 Disease symptoms

2.2 羊肚菌病原菌分離鑒定

2．2．1 病原菌分離純化

通過對病原菌進行分離純化，獲得病原菌菌株YYB1。菌落圓形，氣生菌絲旺盛，白色，菌落背面呈紫色，24℃條件下8 d長滿PDA平板（直徑9 mm），見圖2。

圖2 病原菌菌株菌落形態(tài)Fig．2 Colony morphology of pathogen strain

2．2．2 菌株鑒定

1）顯微形態(tài)鑒定

病原菌分生孢子和厚垣孢子顯微形態(tài)見圖3。

圖3 孢子顯微形態(tài)Fig．3 Morphology of spore

如圖3所示，子實體上感染的霉菌和純化后的病原菌菌株中均發(fā)現(xiàn)形態(tài)一致的分生孢子。觀察發(fā)現(xiàn)，有2種類型的分生孢子：近紡錘形的小孢子，無隔；較直或略彎曲的鐮刀形大型分生孢子，1隔～3隔。厚垣孢子串生，卵圓形。根據(jù)病原菌菌落特征和顯微形態(tài)，可將病原菌菌株初步鑒定為鐮刀菌屬真菌[24-26]。

2）分子系統(tǒng)學鑒定

經(jīng)過DNA提取、擴增、測序和雙向序列校對，病原菌ITS序列與已發(fā)表序列MH856607．1（三線鐮刀菌 Fusarium tricinctum）、KY910897．1（燕麥鐮刀菌 Fusarium avenaceum）、MT294407．1（銳頂鐮刀菌Fusarium acuminatum）、MH864782．1（柔毛鐮刀菌Fusarium flocciferum）、MH863232．1（中華鐮刀菌Fusarium sinense）及 MH855174．1（多枝鐮刀菌Fusarium reticulatum var．negundinis）的相似度都達到99%以上。用能引起羊肚菌白霉病的長毛擬青霉（Paecilomyces penicillatus）作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．4 Phylogenetic tree based on ITS sequences

如圖4所示，根據(jù)ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹只能將病原菌菌株鑒定到鐮刀菌屬，尚無法判斷病原菌的種級分類地位，即不能正確反應鐮刀菌屬真菌種水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，這與趙志慧[24]、易銘[27]等的研究結(jié)果相符。因此結(jié)合形態(tài)學和分子系統(tǒng)學分析，可以將本次樣品中分離純化出的病原菌鑒定為鐮刀菌屬，但具體的種級分類地位還需要結(jié)合更多的序列進行分析。

2.3 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

通過對白霉病導致的羊肚菌絕收樣地土壤進行宏基因組測序，獲得了土壤真菌群落屬水平的組成分布圖，見圖5。

圖5 屬水平的土壤真菌群落組成Fig.5 The composition of the soil sample at the level of the genus

從圖5可知，羊肚菌病害樣地土壤中的真菌除羊肚菌本身外，主要以木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、絲核菌屬（Rhizoctonia）等物種為主。余苗等[19]的研究中發(fā)現(xiàn)曲霉屬真菌能夠引起羊肚菌白霉病，而通過本次研究發(fā)現(xiàn)此次玉溪市羊肚菌白霉病是由鐮刀菌引起。由土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可知，曲霉和鐮刀菌均為病害樣地土壤中的主要微生物。栽培過程中，如果氣候發(fā)生突變后采取措施不及時或栽培管理不規(guī)范，導致棚內(nèi)高溫高濕，就會導致子實體生長受影響，抗感染能力下降，土壤中的鐮刀菌、曲霉等病原微生物就會侵染子實體并快速繁殖造成病害，如處理不及時還可能導致絕收。因此，在羊肚菌栽培中需要針對曲霉和鐮刀菌進行病害的預防，播種前將土壤充分暴曬，必要時可針對性使用食用菌栽培中允許使用的低毒藥物，對土壤和棚內(nèi)環(huán)境進行消毒殺菌處理。

3 結(jié)論與討論

白霉病是羊肚菌栽培過程中的主要病害，主要癥狀為子實體感染白色菌絲。根據(jù)已有的研究報道，長毛擬青霉（Paecilomyces penicillatus）、曲霉（Aspergillus sp.）等均可能引起羊肚菌白霉病。病原菌不同，表現(xiàn)出的傳染性和危害程度也會有差異。

鐮刀菌屬（Fusarium）真菌在自然界中廣泛存在，抗性強，兼寄生或腐生方式生活，生命力旺盛，是引起園林樹木、花卉、蔬菜、小麥、玉米等植物以及雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、平菇（Pleurotus ostreatus）、羊肚菌等食用菌發(fā)生病害的主要病原菌；同時鐮刀菌屬真菌會產(chǎn)生毒素，具有很強的毒性，危害人和動物健康[24,28-33]。本次調(diào)查研究中，羊肚菌白霉病病害傳染性極強，危害嚴重，通過病原菌分離，綜合顯微形態(tài)鑒定和分子系統(tǒng)學鑒定結(jié)果，確定了病原菌為鐮刀菌屬真菌。

羊肚菌為大棚開放式栽培，在栽培過程中受到管理方式和環(huán)境條件的雙重影響，栽培難度相對較高。當管理不當或環(huán)境條件異常，不利于羊肚菌生長，會導致羊肚菌抵抗病害侵染的能力下降，土壤或空氣中的致病菌就會侵染羊肚菌子實體，引起病害。根據(jù)本次土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析，除羊肚菌外，土壤樣品中的主要微生物類群為木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、絲核菌屬（Rhizoctonia）等，其中曲霉屬和鐮刀菌屬真菌都能導致羊肚菌發(fā)生病害[34-35]。據(jù)本次研究結(jié)果可知，此次玉溪市羊肚菌白霉病病害是由鐮刀菌引起。病害的起因是第1潮菇出菇期間，澆水后通風不良，棚內(nèi)氧氣不足，溫度升高，高溫高濕環(huán)境下，羊肚菌子實體抗感染能力下降，土壤中的鐮刀菌感染羊肚菌子實體，大量繁殖，病害快速蔓延導致絕收。因此，曲霉和鐮刀菌都應被當做羊肚菌栽培中的重點預防病原菌。

食用菌與許多病原菌同屬真菌，栽培中病害治理較為困難，病害發(fā)生一般都不可逆，因此病害防控顯得尤為重要。充分了解容易引起病害的病原菌，分析病害規(guī)律，預判病害可能的發(fā)展方向，在栽培前或病害發(fā)生前采取有效手段，減少病原菌的繁殖，營造有利于食用菌生長的環(huán)境條件，能夠有效地預防病害的發(fā)生，降低栽培風險。