吳國嬌,王佩佩,趙玲玲
中南大學湘雅三醫(yī)院,湖南長沙市410013
新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是指圍生期窒息而導致腦的缺氧缺血性損害。當窒息時,由于腦血流量分布不平衡及腦血流自動調(diào)節(jié)功能不完善,導致腦動脈供血區(qū)域血流減少。HIBD是新生兒死亡和致殘的主要原因之一[1]。建立一種模擬其病理過程的動物模型對研究該病至關(guān)重要。本文從建模的方法和模型評價等方面進行綜述。
2004年Yager[2]統(tǒng)計200多例HIBD動物模型的實驗研究,其中模型動物中大鼠應(yīng)用最廣泛(29%),其次是豬和羊。由于大鼠腦的血液供應(yīng)與人類相似,且具有易獲取、花費少等優(yōu)勢,常選擇作為模型動物。但也有采用靈長類動物的[3]。造模時間一般選擇出生后7 d至10 d,該時間段的大鼠腦組織類似于32~40周妊娠胎兒的大腦發(fā)育[4-5]。Bjelke等[6]采用孕鼠建立窒息模型。
模型動物通常雌雄均可。
建模過程包括麻醉方式、藥物和造模方法的選擇。常用的麻醉方式有吸入麻醉和注射麻醉兩種。Chen等[7]在關(guān)于延長異氟烷暴露時間能否改善HIBD大鼠腦梗死程度的研究中提出,常用吸入麻醉藥物(地氟烷、氟烷、異氟烷等)和靜脈注射麻醉藥物(巴比妥類、丙泊酚等)均對HIBD有不同程度的神經(jīng)保護作用。駱健明等[8]也發(fā)現(xiàn)麻醉組大鼠腦組織病變不明顯,非麻醉組腦組織變性、壞死顯著,說明麻醉藥物對腦損傷有不同程度的保護作用。
主要的造模方法包括阻斷動脈血管、夾閉氣管和建立宮內(nèi)缺氧環(huán)境等。其中阻斷動脈血管的方法有單側(cè)頸總動脈結(jié)扎(unilateral carotid artery occlusion,UCAO)、雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(bilateral carotid artery occlusion,BCAO)和大腦中動脈閉塞等。
1960年,Levine[9]采用結(jié)扎頸總動脈和缺氧在成熟大鼠建立腦缺氧缺血模型。1981年Rice等[4]在Levine的基礎(chǔ)上將成熟大鼠改為新生大鼠,建立HIBD模型,被人稱為Rice模型。其后很多學者對該模型進行改良,現(xiàn)已成為研究HIBD的經(jīng)典模型[10-11]。有人提出手術(shù)時間應(yīng)控制在10 min以內(nèi),以提高腦梗死的一致性[11-12]。術(shù)后休息1.5~2 h。若休息時間太短,大鼠存活率將降低;若延長,梗死變異性將增大[12-13]。較低(3%~4%)氧濃度主要用于誘導急性缺氧,而較高(7%~10%)氧濃度誘導慢性缺氧[14-15]。術(shù)后暴露于含有8%O2的缺氧箱中90 min或180 min,可分別誘導不同程度的腦損傷[16-17]。Rice模型操作簡單,成功率高。由于Willis環(huán)的對側(cè)代償,單獨的缺血并不能造成腦損傷,只有聯(lián)合缺氧導致血管低氧張力才能誘導腦損傷[4,18]。
1991年,Schwartz等[19]改良Rice模型,將單側(cè)頸總動脈結(jié)扎改為雙側(cè)結(jié)扎,休息4~6 h置于6.5%O2的缺氧箱內(nèi)1 h建立BCAO聯(lián)合缺氧誘導HIBD的模型,并發(fā)現(xiàn),缺氧時間從15~60 min,死亡率從0上升到32%。Le Blanc等[20]在出生0~3 d新生豬上應(yīng)用該方法造模,結(jié)扎雙側(cè)頸動脈30 min,在含6%O2的缺氧箱中15 min,復制了新生豬HIBD模型。該模型較穩(wěn)定,可以造成較為一致的HIBD,但技術(shù)要求高,較難實施[21]。
Derugin等[22]采用尼龍絲閉塞出生后7 d大鼠的大腦中動脈(middle cerebral artery,MCA),3 h后取出尼龍絲建立短暫性大腦中動脈閉塞模型。也有研究發(fā)現(xiàn),單獨MCA閉塞和短暫UCAO(1 h)未發(fā)現(xiàn)明顯的缺血損傷;而電凝MCA聯(lián)合短暫性UCAO(1 h)可觀察到明顯的腦梗死和神經(jīng)細胞凋亡、壞死[23]。因此推薦電凝MCA聯(lián)合同側(cè)UCAO 1 h建立永久性大腦中動脈閉塞模型。但這兩種方法的整個過程只是腦缺血,并沒有降低吸入氧濃度,與圍產(chǎn)期HIBD的再灌注過程相似。該模型能產(chǎn)生明確的梗死,但技術(shù)難度大,目前較少使用。
2017年,徐穎等[24]麻醉出生后7 d大鼠后,分離氣管,用血管夾夾閉氣管造成缺氧,稱氣管夾閉法。缺氧時間從8 min延長至14 min時,大鼠存活率從83.3%降低到26.7%。在損傷早期,缺氧大鼠均出現(xiàn)相似的臨床腦損傷病理改變,包括壞死、出血和核固縮等。該造模方法操作簡便,能準確地控制缺氧時間,與HIBD臨床病理生理過程相似,值得推廣。
有很多學者選取妊娠動物建模。Bjelke等[6]將即將生產(chǎn)的孕鼠子宮外置于含生理鹽水的37℃水浴箱中,建立HIBD窒息模型。窒息時間超過15 min后,死亡率快速上升[25]。該模型減少了手術(shù)和麻醉的影響。薄濤等[26]通過結(jié)扎孕鼠雙側(cè)子宮動脈建模,但方法復雜,技術(shù)要求高,現(xiàn)很少使用該方法造模。后來,Tan等和王能里等[27-28]在妊娠后期孕兔經(jīng)股動脈插入Fogarty取栓導管,向球囊內(nèi)注入生理鹽水以阻斷子宮動脈血供,建立HIBD模型。該方法與傳統(tǒng)結(jié)扎子宮動脈法比較,操作簡便,術(shù)后恢復快等。
術(shù)后1~3 d肉眼觀察腦組織外觀,發(fā)現(xiàn)損傷側(cè)腦組織明顯水腫、軟化;術(shù)后7 d水腫減輕,腦萎縮及空洞形成[29]。術(shù)后72 h內(nèi)分別稱量大鼠腦半球濕重及干重,并計算水含量百分比,結(jié)果表明模型組含水量顯著高于對照組[30],說明HI損傷后可引起腦組織水腫。
評估腦梗死的染色方法主要是指2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色,一般在術(shù)后24~72 h進行,觀察到HIBD組梗死體積與對照組比較明顯增大[10]。亦可采用TUNEL染色、組織化學染色等方法進一步確定分子水平的腦損傷[10,31]。TUNEL染色是通過定位DNA片段檢測細胞凋亡,HIBD組大鼠凋亡細胞數(shù)明顯增多[32]。用蘇木素-伊紅染色,與對照組比較,HIBD組細胞腫脹,排列紊亂,出現(xiàn)廣泛神經(jīng)元丟失和壞死,明顯的神經(jīng)膠質(zhì)細胞異常增生[30,33]。李玉宇等[34]的研究發(fā)現(xiàn),在尼氏染色中,HIBD組相比于對照組可觀察到,海馬區(qū)部分神經(jīng)元腫脹,排列紊亂,形態(tài)不規(guī)則。
對腦缺氧缺血性損傷敏感的影像學手段主要包括正電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomography,PET)、磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)等技術(shù)。Kannan 等[35]分別給正常和腦損傷新生幼兔靜脈注射11C-(R)-PK11195(活化小膠質(zhì)細胞示蹤劑),行PET掃描發(fā)現(xiàn),腦損傷幼兔腦內(nèi)11C-(R)-PK11195濃度與時間呈正相關(guān),而正常組相反,說明腦損傷后有小膠質(zhì)細胞的活化。但PET掃描具有放射性。MRI技術(shù)可定位腦損傷部位和范圍,在評估腦損傷程度及預測遠期行為方面具有重要價值[11]。Vial等[36]通過T2加權(quán)MRI手段發(fā)現(xiàn)腦損傷面積變化具有時間依賴性,術(shù)后3 d顯著增加7 d達到高峰,隨后逐漸減少,減少的損傷面積可反應(yīng)水腫逐漸溶解消散。MRI技術(shù)具有客觀、安全、敏感性高等優(yōu)點,是影像學中常用的技術(shù)。
術(shù)后1 h和24 h,采用翻正反射、懸崖調(diào)轉(zhuǎn)反射和向地性反射等方法評估幼鼠的感覺運動功能。Ten等[37]發(fā)現(xiàn)感覺運動功能的評分高低與急性期腦損傷程度呈正相關(guān),HIBD大鼠隨缺氧時間的延長,功能評分越高,表明感覺運動功能損傷越嚴重。其對遠期神經(jīng)功能具有很強的預測價值。亦可在術(shù)前和術(shù)后8 h、16 h或24 h按Longa 5分法評估腦損傷程度,HIBD組Longa分數(shù)顯著高于對照組,且評分越高,神經(jīng)功能損傷越嚴重[30,32]。但Ikeda等[38]的研究發(fā)現(xiàn),HIBD大鼠盡管存在學習障礙,但感覺運動功能幾乎不受影響。
采用行為學方法對模型進行遠期評估。常用行為學方法包括Morris水迷宮實驗、曠場實驗和平衡木實驗等。
Morris水迷宮實驗是一種評價動物神經(jīng)運動能力和空間學習能力的客觀方法,通過測定逃避潛伏期和平臺跨越次數(shù)評估大鼠的空間學習記憶能力,可在出生后28~90 d的時間段開始該實驗[31,33,39]。HIBD后大鼠運動表現(xiàn)和學習能力與腦梗死體積和腦萎縮程度相關(guān)。Arteni等和Ikeda等[31,38]發(fā)現(xiàn),Rice模型的不同側(cè)腦半球損傷動物水迷宮實驗結(jié)果不同,但相比于對照組,HIBD組平均潛伏期明顯較長,且穿越平臺次數(shù)較少,但游泳速度無明顯差異。提示有明顯的空間學習記憶功能減弱,而運動功能無明顯影響。在曠場試驗中,通過記錄動物在中央格的停留時間來反映其認知能力。停留時間延長反映認知能力差[40]。Peterson等[13]和Iqbal等[40]發(fā)現(xiàn),HIBD組和對照組動物的曠場運動結(jié)果無明顯差異。但陳飛[41]通過夾閉孕鼠子宮動脈誘導HIBD模型的研究中發(fā)現(xiàn),HIBD組出生后21 d大鼠與對照組比較,中央格停留時間最長,兩組有差異。而在出生后14 d、28 d、35 d、49 d時,兩組無明顯差異。利用平衡木實驗評估動物的平衡和運動協(xié)調(diào)能力[7,13]。Peterson等[13]發(fā)現(xiàn),HIBD組和對照組的表現(xiàn)無明顯差異。而陳剛等[42]和庒蕾等[43]實驗顯示,HIBD動物在通過橫桿時,神態(tài)躊躇不定。只有當轉(zhuǎn)速>50 r/min時,HIBD組與對照組和惰性氣體處理組比較,協(xié)調(diào)能力變差和在平衡木的滯留時間縮短。提示HIBD對高難度平衡運動能力影響明顯,而對低難度運動能力損傷較小。
行為學評估的結(jié)果很容易受實驗者或觀察者主觀的影響,所以對HIBD模型的評定,應(yīng)該以主觀觀察與客觀手段相結(jié)合。因此,神經(jīng)行為學的檢測雖然很重要,但仍需結(jié)合組織病理學和影像學等手段。
各種HIBD模型均有利弊,應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的模型。目前,應(yīng)用最廣泛的是Rice模型及其改良模型,但該方法造成的腦損傷變異程度大,梗死不明顯,將缺血缺氧分成兩部分,并不能完全的復制HIBD的發(fā)病過程,因此仍需改進以提高腦損傷程度一致性,減少個體之間的變異。對于HIBD的研究,國內(nèi)外研究現(xiàn)仍未有判斷建模成功的標準方法,接下來需要探索哪種方法能更好地對HIBD模型進行評估。