豬血凝性腦脊髓炎病原學特征及檢測技術(shù)研究進展

莊金秋，阮　震，梅建國，張　穎，楊麗梅，李　峰

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州　256600；2.濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司，山東濱州　256600；3.濱州市濱城區(qū)里則街道辦事處畜牧獸醫(yī)工作站　256656）

豬血凝性腦脊髓炎（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis，PHE）是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬血凝性腦脊髓炎病毒（Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV）感染引起的一種仔豬急性、高度接觸性傳染病。本病主要侵害1～3周齡哺乳仔豬，以仔豬嘔吐、衰竭或顯著神經(jīng)癥狀為主要臨床特征，死亡率高達20%～100%[1]。自1958年該病在加拿大安大略省首次暴發(fā)以來[2]，已在世界范圍內(nèi)廣泛分布，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重經(jīng)濟損失。本文簡要概述了PHEV的病原學特征及檢測技術(shù)研究進展，以期為防治該病提供參考。

1　病毒的發(fā)現(xiàn)

PHEV最早于1958年在加拿大安大略省的豬群中被發(fā)現(xiàn)。當時于乳豬中發(fā)現(xiàn)2種臨床表現(xiàn)不同的疾病，一種以突然發(fā)生嘔吐、繼以消瘦為特征，稱為豬嘔吐消瘦?。涣硪环N主要表現(xiàn)為腦脊髓炎癥狀，稱為豬腦脊髓炎[2]。1971年證明這2種病癥均由同一種冠狀病毒PHEV引起。我國最早于1986年報道該病。1993年我國臺灣地區(qū)發(fā)生大規(guī)模PHE流行，大型豬場仔豬發(fā)病率達30%，病死率幾乎達100%，造成了嚴重經(jīng)濟損失[3]。近年來，PHEV在我國多個豬群中被發(fā)現(xiàn)，其危害性呈上升趨勢。

2　病毒的分類地位

PHEV屬于冠狀病毒科冠狀病毒亞科乙型冠狀病毒屬成員[4]。豬是該病毒的唯一自然宿主。冠狀病毒科下設冠狀病毒亞科與環(huán)曲病毒亞科，冠狀病毒亞科根據(jù)病毒抗原的差異性又分為3個屬，依次是甲型冠狀病毒屬、乙型冠狀病毒屬和丙型冠狀病毒屬[5]。2003年暴發(fā)流行的SARS冠狀病毒，其結(jié)構(gòu)明顯不同于上述3種冠狀病毒群，被劃分為第四類環(huán)狀病毒群。鴨冠狀病毒、馬冠狀病毒、水貂冠狀病毒及果子貍冠狀病毒也從屬于該類病毒群體[6]。

3　病毒的病原學特征

3.1　形態(tài)特征及理化特性

PHEV在形態(tài)上為典型的冠狀病毒，直徑為120～170 nm，呈球形或橢圓形，有囊膜，囊膜上有花瓣樣纖突[2]。該病毒最大特性表現(xiàn)在被感染細胞可吸附紅細胞，能凝集雞、小鼠、大鼠、倉鼠和火雞等動物的紅細胞。PHEV在56 ℃、30 min或37 ℃、72 h條件下，可被滅活；在凍干和低溫時比較穩(wěn)定，冰凍狀態(tài)下可存活1年以上；對如乙醚、氯仿及去氧膽酸鈉等脂溶劑敏感，不耐熱[7]。

3.2　基因組結(jié)構(gòu)及功能

PHEV為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒。纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、血凝素-酯酶蛋白（HE）、核衣殼蛋白（N）及小膜蛋白（SM或E）5種蛋白共同構(gòu)建了病毒粒子的外部框架。這5種蛋白功能各異，共同維持著病毒粒子正常的生物功能。結(jié)構(gòu)蛋白S蛋白，是含有抗原表位最多的結(jié)構(gòu)蛋白，主要參與病毒感染宿主細胞時的特異性結(jié)合；E蛋白（或稱SM蛋白）能夠維持 PHEV囊膜結(jié)構(gòu)；M蛋白是整個病毒粒子中含量最高的結(jié)構(gòu)蛋白；HE蛋白是一類特殊糖蛋白，只存在于部分冠狀病毒當中，能使紅細胞發(fā)生凝集；N蛋白有3個高度保守區(qū)域，其中序列“FYYLGTGP”存在于所有冠狀病毒當中，使得 N蛋白是所有結(jié)構(gòu)蛋白中同源性最高的蛋白[6]。

3.3　培養(yǎng)特性

PHEV可在原代豬腎細胞、脾細胞、甲狀腺細胞和睪丸細胞等細胞中增殖，其特征性細胞病變（CPE）是多核巨細胞的形成。病毒感染具有2～4 h的隱蔽期，于感染后12～16 h產(chǎn)生大量的子代病毒，即可見到多核巨細胞（融合細胞）[8]。

4　病毒的流行病學與致病性

在自然條件下，該病僅感染豬，尤其是哺乳仔豬易感，較大的豬多為隱性感染，且隱性感染率很高。病毒通常存在于病豬的上呼吸道及腦組織中，經(jīng)口、鼻感染發(fā)病。不同毒株感染不同日齡豬只后，臨床表現(xiàn)明顯不同。在老疫區(qū)，母豬初乳中含有該病毒抗體，因而哺乳仔豬一般呈隱性感染，斷奶仔豬已能抵抗該病。新疫區(qū)以3周齡以內(nèi)的哺乳仔豬易感，多數(shù)是在引進新種豬之后發(fā)病。感染仔豬通常具有腦脊髓炎型和嘔吐消耗型2種臨床表現(xiàn)型[9-10]。前者多為急性暴發(fā)，可以在患病早期發(fā)現(xiàn)，具有較明顯的神經(jīng)癥狀，具有腦脊髓炎的典型特征；后者由于表現(xiàn)形式多為嘔吐或生長緩慢，所以很容易被診斷為胃腸疾病或營養(yǎng)缺乏，是一種慢性臨床表型。出現(xiàn)這2種截然不同臨床癥狀的原因，與病毒本身毒力，以及易感動物自身年齡、抵抗能力和個體差異有關(guān)[11]。隱性感染豬雖不發(fā)病，但會向周圍環(huán)境散毒，而且病毒在宿主體內(nèi)長時間復制，極有可能發(fā)生基因變異，使病毒毒力增強。隱性感染豬群亦會相繼消瘦，發(fā)育遲緩，嚴重影響經(jīng)濟效益。

5　病毒的檢測技術(shù)研究進展

5.1　病毒分離與鑒定

PHEV能夠在PK15、N2a和SK等多種細胞中增殖，從而使宿主細胞發(fā)生感染[12]。無菌采集病豬的腦、肺或呼吸道分泌物等主要發(fā)病組織，經(jīng)處理后接種于PK-15細胞或甲狀腺單層細胞進行培養(yǎng)，如果有PHEV存在，可在接種后24～48 h出現(xiàn)融合細胞。用血凝試驗（HA）對樣品進行檢測，對陽性樣品盲傳3代后收取病毒液，反復凍融后離心，取沉淀物，采用磷鎢酸進行負染；將負染后的樣品置于透射電鏡下觀察，如有典型的冠狀病毒粒子出現(xiàn)，則可確診為PHEV感染。病毒分離鑒定準確可靠，但對無菌環(huán)境要求嚴格，還進行活病毒培養(yǎng)，費時費力，操作復雜。

5.2　血清學方法

5.2.1血凝/血凝抑制試驗（HA/HI） PHEV表面的HE蛋白能夠誘導抗體并中和病毒感染，同時可以凝集小鼠和雞的紅細胞。針對這一特點，可以應用HA/HI試驗進行檢測。劉立卓等[13]應用HA/HI試驗對從山東省部分地區(qū)采集的178份豬血清樣品進行了PHEV抗體檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率高達61.24%（109/178），表明該地區(qū)PHEV感染較為普遍。由于仔豬可以通過初乳獲得PHEV抗體，因此血清學調(diào)查可能存在一定的假陽性，并不能真實反映PHEV感染情況。另外，HI試驗還有主觀性強、對判定結(jié)果的解釋難以標準化，以及不適合大批量檢測等缺點。

5.2.2中和試驗（NT） 中和試驗是檢測血清中和抗體最常用的方法。Sasaki等[14]在FS-L3細胞上建立了檢測PHEV的中和試驗。另外，其他易感細胞，如成年豬的甲狀腺細胞、睪丸細胞、PK-15細胞和SK細胞等細胞，均可用于PHEV中和試驗。中和試驗靈敏可靠，特異性高，但費時費力，操作復雜，操作人員需具備一定的專業(yè)水平，僅適合在實驗室操作，不適用于大規(guī)模臨床血清學監(jiān)測。

5.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） ELISA方法具有靈敏度高、特異性強、試驗結(jié)果穩(wěn)定和極易于自動化操作等優(yōu)點，已被廣泛應用于PHEV血清抗原/抗體的檢測。陳克研[15]制備PHEV N蛋白單克隆及多克隆抗體，成功構(gòu)建并組裝了雙抗夾心ELISA抗原診斷試劑盒。應用該試劑盒與實驗室建立的RT-PCR檢測方法，分別對人工感染小鼠和對從吉林省采集的200份疑似病豬樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)2種方法陽性檢出符合率都在90%以上。趙傳博等[16]應用制備的PHEV單克隆抗體作為檢測抗體，豬多抗作為捕獲抗體，建立了PHEV抗原捕獲ELISA方法，其最低檢測下線為3.75 mg/L。劉立卓等[13]以純化的PHEV全病毒作為包被抗原，建立了PHEV抗體間接ELISA方法，應用該法對從山東省豬血清中隨機抽取的44份樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)PHEV抗體陽性率為72.73%（32/44），而HI抗體陽性率為56.82%（25/44），2種檢測方法的陽性符合率為92%。單長見等[17]以可溶性表達的PHEV重組N蛋白作為包被抗原，建立了PHEV血清抗體間接ELISA方法，用該法對從天津市采集的200份豬血清樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性檢出率為83.50%，與前期工作中建立的全病毒作為包被抗原的間接ELISA方法檢測結(jié)果符合率為90.91%。該方法為臨床檢測PHEV感染及流行病學調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

5.2.4間接免疫熒光（IFA） Andrie等[18]最先將PHEV接種于仔豬，在免疫熒光下發(fā)現(xiàn)PHEV主要的復制部位是鼻黏膜、扁桃體、肺和小腸上皮細胞，得到了PHEV抗原在細胞上的初步定位。IFA技術(shù)具有很多優(yōu)點，不需專業(yè)人員操作，簡便易行，消耗時間較短，適合在養(yǎng)殖場推廣和應用。但由于該方法必須要通過熒光顯微鏡進行觀察，只能夠做出定性結(jié)果，而不能準確定量，所以也在存在一定弊端。

5.2.5膠體金免疫層析技術(shù)（GICA） 陳克研[15]將單克隆抗體技術(shù)與GICA結(jié)合，制備了PHEV膠體金免疫層析試紙條（ICS）。試驗證明，該試紙條與ELISA和HI的相關(guān)性分別為96.90%和96.69%。應用ICS對吉林省和遼寧省部分地區(qū)進行血清抗體調(diào)查，發(fā)現(xiàn)672份血清樣本中，有334份呈陽性，總陽性率為49.70%，表明被檢測地區(qū)豬群中普遍存在PHEV感染。試紙條具有使用便捷、靈敏度高、特異性強且結(jié)果容易判斷等優(yōu)點。

5.2.6免疫組織化學技術(shù)（IHCT） IHCT具有特異好、敏感性高和精準度高等特點，是實驗室內(nèi)進行分子病理學相關(guān)研究的技術(shù)方法。Quiroga等[21]應用此技術(shù)，對2006年阿根廷的PHEV感染病死豬進行了形態(tài)學和抗原定位。IHCT同IFA一樣，能夠高特異性地定位抗原，并且在疾病診斷中獲得針對該病原的典型性特征，使其在免疫病理學診斷中得到廣泛應用。然而，該技術(shù)對試驗器材要求很高，對于基層養(yǎng)殖業(yè)來說，并不是一種實用的診斷技術(shù)。

5.3　分子生物學方法

5.3.1RT-PCR Sekiguchi等[22]根據(jù)PHEV的S蛋白設計引物，建立了巢式RT-PCR方法，用于檢測PHEV。常靈竹等[23]根據(jù)PHEV的HE基因和S基因等設計出特異性引物，建立了PHEVRT-PCR檢測方法，最低可檢測到10 TCID50/100 μL的病毒，具有較好的特異性和敏感性。用此RT- PCR方法對感染PHEV的小鼠和豬進行檢測，能從發(fā)病動物的多種組織中檢測到病原，其中腦組織的檢出率最高，提示臨床疑似病例檢測時以腦組織為最佳檢測樣本。

5.3.2熒光定量RT-PCR 臧德躍等[24]根據(jù)PHEVS蛋白基因的保守序列設計特異性引物，建立了PHEV的SYBR Green Ⅰ熒光定量RT-PCR方法，應用該方法對采集的20份疑似PHEV感染病料進行檢測，發(fā)現(xiàn)16份為陽性，而用常規(guī)RTPCR檢測同樣的樣品，僅8份為陽性，表明其建立的方法具有快速、特異、敏感和重復性好等優(yōu)點，可用于臨床PHEV檢測及定量分析。熒光定量RTPCR方法不僅為PHE早期快速診斷提供了良好的技術(shù)手段，也為從分子水平上深入了解PHEV致病機制及有效防治PHE奠定了基礎(chǔ)。

5.3.3環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP） 丁寧[19]根據(jù) PHEV較為保守的M基因序列，設計合成了2對LAMP引物，通過優(yōu)化反應條件，建立了用于PHEV的LAMP方法，應用該方法對從吉林省某豬場采集的15份疑似PHEV感染病例樣本進行初步檢測，同時用實驗室已經(jīng)建立的熒光定量PCR檢測方法作為對照。結(jié)果顯示，LAMP方法和熒光定量 PCR方法檢測的陽性率均為47%（7/15），符合率為100%。尹洋等[20]也研制出一種PHEV的LAMP檢方法，并對該病毒進行了檢測。結(jié)果顯示其敏感性要比傳統(tǒng)的PCR技術(shù)高許多，且用時短。

6　小結(jié)

雖然近年來PHEV引發(fā)疾病的大規(guī)模暴發(fā)流行較少，但是根據(jù)賀文琦等[25]的血清學調(diào)查結(jié)果可以推測，該病原在我國部分地區(qū)的飼養(yǎng)豬群中十分普遍。許多基層獸醫(yī)工作者還沒有意識到該病的嚴重性，所以即使臨床上發(fā)生該病，也可能被忽略或誤診。如果在大型豬場發(fā)生該病，危害將是十分嚴重的。仔豬一旦發(fā)病，極少康復。母豬發(fā)病后2～3周產(chǎn)出的仔豬一般可通過母源抗體獲得保護[26]。該病尚無有效的治療藥物和疫苗，主要依靠加強綜合性防治和注重口岸檢疫，防止引入病豬。PHEV病原學、血清學和分子生物學檢測方法各有優(yōu)缺點和實用性，需要根據(jù)不同的場合和條件等選擇合適的方法。雖然上述檢測方法為PHEV檢測提供了有效的技術(shù)手段，但是隨著人們對PHEV研究的深入，相信現(xiàn)有的檢測方法將不斷得到改進，也可能研制出新的檢測方法，使PHEV檢測更簡便、快速和準確。

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