乙型肝炎分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法的應(yīng)用及質(zhì)量控制

馬 雯

（寧夏人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)診斷中心，寧夏 銀川 750004）

作為臨床最為常見的傳染性疾病，乙型肝炎患者中每年都有數(shù)以百萬的死亡例數(shù)。慢性乙型肝炎是HBV感染后的一種嚴(yán)重結(jié)果。在全球范圍內(nèi)，我國(guó)乙型肝炎病毒感染率位居前列。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)現(xiàn)如今已有1.3億人群屬于乙型肝炎病毒攜帶者，慢性肝炎患者的數(shù)量已經(jīng)超過2300萬。我國(guó)病毒性肝炎患者接受治療時(shí)產(chǎn)生的直接費(fèi)用可達(dá)到500億元。因此，準(zhǔn)確、高效檢測(cè)乙型肝炎病毒對(duì)預(yù)防和治療具有非常重要的意義。

1 常規(guī)乙型肝炎檢驗(yàn)

通常情況下，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是臨床檢測(cè)乙型肝炎病毒感染的常見指標(biāo)，同時(shí)也是肝功能與血清免疫標(biāo)志物。常見性的乙型肝炎血清標(biāo)志物主要包括了HBcAg與抗-HBc、HbeAg與抗-Hbe、HBsAg和抗-Hbs。ELISA是臨床中應(yīng)用比較多的檢測(cè)方法。該種檢測(cè)方法能夠?qū)BV的應(yīng)答系統(tǒng)與表達(dá)物檢測(cè)到，并能夠確定病毒感染后的免疫情況，同時(shí)還可了解乙型肝炎病毒在患者體內(nèi)的復(fù)制狀況。ELSA檢驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單、方便、快捷[1-3]。但敏感度并不是非常高。最近幾年，國(guó)內(nèi)外開始報(bào)道乙型肝炎病毒基因突變，分析HBsAg突變基因表達(dá)產(chǎn)物，就能夠?qū)⒉煌耐蛔凅w存在的抗原差異顯示出來。因此，即便臨床檢驗(yàn)的時(shí)候，使用的是相同的血清，可最終獲得的檢測(cè)結(jié)果就可能出現(xiàn)差異，由此也就表明臨床指標(biāo)存在漏檢的現(xiàn)象。

2 HBV分子生物學(xué)檢測(cè)

HBV-DNA是生物分子學(xué)常用的檢測(cè)指標(biāo)。根據(jù)該指標(biāo)可確定乙型肝炎病毒是否存在、陰干病毒的活性和傳染性等情況。檢測(cè)該指標(biāo)利用常規(guī)的聚合酶鏈反應(yīng)和熒光定量PCR方法。

2.1 常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)法：該種檢驗(yàn)方法的原理類似于DNA復(fù)制過程。該過程主要由變性、退火、延伸等步驟構(gòu)成。模板溫度達(dá)到93 ℃后，雙鏈就會(huì)在環(huán)境的作用下斷裂為單鏈，單鏈就會(huì)引導(dǎo)DNA與引物結(jié)合。模板溫度下降55 ℃時(shí)，模板上的DNA就會(huì)與引物相互配對(duì)結(jié)合。在TapDNA聚合酶的指引下，DNA模板-引物復(fù)合物就會(huì)在相應(yīng)的原料下合成新的復(fù)制鏈。在此期間，不斷重復(fù)這種過程，就會(huì)獲得數(shù)量較多的半保留復(fù)制鏈。如此往復(fù)循環(huán)，每循環(huán)過程需花費(fèi)2～3 min，在數(shù)小時(shí)內(nèi)就可將基因擴(kuò)至龐大規(guī)模。此種檢測(cè)方法的靈敏度可達(dá)到ng水平，檢測(cè)結(jié)果能夠直接反應(yīng)出HBV病毒的復(fù)制情況，從而為臨床診斷提供根據(jù)[4-7]。但這種檢測(cè)方法不能對(duì)準(zhǔn)確基因定量、擴(kuò)增污染物的假陽(yáng)性和操作復(fù)雜等問題，由此影響臨床使用效率。

2.2 熒光定量方法：熒光定量是在PCR擴(kuò)增期間將熒光素標(biāo)記的特異性引物，在擴(kuò)增中不斷出現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移，減弱熒光強(qiáng)度。經(jīng)過多個(gè)循環(huán)后，PCR反應(yīng)的熒光強(qiáng)度和模板的量就是檢測(cè)指標(biāo)中HBV-DNA拷貝的數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)定量的效果。應(yīng)用熒光定量方法，可檢測(cè)HBV-DNA期間，還能夠進(jìn)行量化，以此就可更好的了解乙型肝炎患者體內(nèi)HBV復(fù)制和傳染性，并反映出復(fù)制水平、病變程度和治療進(jìn)展。具有較高的特異性，靈敏度也非常高[8-10]。實(shí)際應(yīng)用此種檢驗(yàn)方法，無需處理PCR的產(chǎn)物。且通過閉關(guān)操作，可避免污染引起的假陽(yáng)性。在此期間，使用實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，所獲取的Ct值和原始模板數(shù)量表現(xiàn)出線性關(guān)系，可準(zhǔn)確定量。該種方法具有PCR高靈敏度的同時(shí)，還可使用熒光探針。利用光電傳導(dǎo)系統(tǒng)就可將PCR擴(kuò)增期間的熒光信號(hào)探測(cè)到，以此獲得定量結(jié)果，還具有DNA雜交的高特異性和光譜的高精確性，能夠彌補(bǔ)PCR缺陷。熒光定量PCR在實(shí)際應(yīng)用中顯示出獨(dú)特的診斷價(jià)值。治療前對(duì)病毒定量檢測(cè)，由此就可指導(dǎo)抗病毒藥物的使用，以免盲目用藥；治療后通過PCR能夠直接準(zhǔn)確測(cè)定患者體內(nèi)的病毒情況，有利于判斷臨床效率；懷孕前測(cè)定PCR，有助于選擇最佳的懷孕時(shí)機(jī)；乙型肝炎孕婦檢測(cè)PCR，可及時(shí)診斷病情。

3 HBV生物學(xué)檢測(cè)的質(zhì)量控制

HBV生物學(xué)檢測(cè)的質(zhì)量控制對(duì)臨床診斷具有重要意義。首先，特異性。檢測(cè)HBV-DNA，通過對(duì)核酸序列特異性的檢測(cè)，就能夠?qū)A基的特異性區(qū)別開[11-16]。在此過程中，需應(yīng)用熒光定量檢測(cè)技術(shù)的熒光產(chǎn)生的溫度、離子濃度以及探針，經(jīng)過不斷的優(yōu)化處理后，就可有效減少非特異性擴(kuò)增。在此過程中，要實(shí)現(xiàn)特特異性擴(kuò)增，還應(yīng)注意聚合酶的選擇、溫度以及離子濃度等各方面影響因素。因而，在此過程中還需建立優(yōu)化的擴(kuò)增系統(tǒng)，才有利于BBV分子生物學(xué)檢測(cè)。其次，靈敏度。實(shí)際操作中，靈敏度的影響因素主要包括樣品的競(jìng)爭(zhēng)性抑制物和其他抑制因子。對(duì)于不同核算擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作人員和實(shí)驗(yàn)室均會(huì)影響靈敏度。其中PCR就遇到此種情況。因此，需加強(qiáng)各類因素指標(biāo)的規(guī)范性，如統(tǒng)一試劑、操作人員對(duì)曲線上陰/陽(yáng)性截取的統(tǒng)一等。最后，重復(fù)性。隨機(jī)擴(kuò)增，樣品量少，變化性因素越多。此時(shí)就應(yīng)當(dāng)控制模板的循環(huán)數(shù)目，建立假陽(yáng)性耐受性指標(biāo)。在實(shí)驗(yàn)操作中，改善擴(kuò)增和測(cè)定方法的同時(shí)，樣本制備同樣非常重要，由此就能夠避免定量測(cè)定的差異性。另外還有樣本對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響加強(qiáng)控制。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控和實(shí)驗(yàn)間質(zhì)評(píng)同樣可達(dá)到質(zhì)量控制效果。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控可以購(gòu)自公司，也可以自行配制；實(shí)驗(yàn)間質(zhì)評(píng)可通過參加國(guó)家衛(wèi)計(jì)委臨檢中心每年兩次的室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)。

4 結(jié) 語(yǔ)

乙型肝炎病毒生物學(xué)檢驗(yàn)中，熒光定量PCR是目前最為理想的檢驗(yàn)方法，在確定檢驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)與質(zhì)量控制的基礎(chǔ)上，才能夠采取預(yù)防性措施，發(fā)揮技術(shù)優(yōu)勢(shì)，預(yù)防假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果出現(xiàn)。