超聲微泡攜基因治療肝臟疾病應(yīng)用進展

席佳達，夏國園*，程祖勝

(1.紹興文理學院醫(yī)學院，浙江 紹興 312000；2.紹興市第七人民醫(yī)院放射科，浙江 紹興 312000)

隨著超聲微泡造影劑(ultrasound contrast agent, UCA)、超聲靶向微泡破壞(ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD)技術(shù)與超聲微泡攜基因(ultrasound microbubble carrying gene, UMCG)技術(shù)的發(fā)展與成熟，超聲微泡的治療作用日漸突顯, 通過靶向微泡造影劑(targeted microbubbles contrast agent, TMCA)靶向傳輸基因、UTMD的空化效應(yīng)增強基因的轉(zhuǎn)染率，可靶向治療疾病。UMCG已用于治療多種疾病。本文主要圍繞UMCG治療肝臟疾病的應(yīng)用進展進行綜述。

1 概述

1.1UCA的發(fā)展 UCA的發(fā)展歷經(jīng)3個階段：第1代造影劑內(nèi)含自由氣體，無外膜包被，顆粒較大，穩(wěn)定性差；第2代造影劑外包白蛋白、脂質(zhì)、表面活性劑或聚合物等殼膜，穩(wěn)定性增加，直徑也縮小至8 μm以下，可通過靜脈注射；第3代造影劑內(nèi)含氟碳或氟硫類氣體，外有殼膜包被，可在血液中持續(xù)15 min以上，穩(wěn)定性大大提高。

1.2TMCA 與普通UCA相比，TMCA表面連接特異性的配體或抗原，經(jīng)靜脈注射后可到達感興趣區(qū)。各類藥物或基因通過共價鍵或靜電連接在靶向微泡表面或直接包裹入微泡內(nèi)，既能有效防止藥物或基因被血液中的物質(zhì)分解，又能將藥物或基因運送至目標區(qū)域。與傳統(tǒng)的病毒、非病毒載體相比，微泡作為基因載體具有安全、定向及有效等特點。

1.3UTMD 通過對目標區(qū)域施加一定頻率的超聲使微泡破裂，定位釋放出微泡內(nèi)的藥物或基因，產(chǎn)生空化效應(yīng)，使血管內(nèi)皮細胞及靶細胞的細胞膜通透性暫時增加、細胞間隙增寬，在細胞膜及核膜上產(chǎn)生聲孔，促進細胞的內(nèi)吞作用，增加其對大分子物質(zhì)的吸收，使外源基因更易進入目標組織，具有安全性高及靶向性強的特點。

2 UMCG在肝臟疾病治療中的應(yīng)用

2.1肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 我國HCC發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌，每年死亡人數(shù)達32.1萬[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)UMCG可抑制肝癌細胞轉(zhuǎn)移、生長，或誘導(dǎo)HCC凋亡。1986年Moolten等首次報道通過將單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞，可提高核苷類似物(nucleoside analoges, NSA)殺傷腫瘤細胞的敏感度。HSV-TK自殺基因是一種前藥酶基因，可通過磷酸化作用使前藥丙氧鳥苷(ganciclovir, GCV)轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎拘运幬?，達到抗腫瘤作用。Zhou等[3]利用超聲靶向破壞包裹HIV-TK基因的質(zhì)粒，經(jīng)過48 h轉(zhuǎn)染后，HSV-TK+超聲+微泡+GCV組胸腺激酶(thymidine kinase, TK)蛋白表達明顯增強，而TK蛋白在目標區(qū)域的有效表達是HSV-TK/GCV治療腫瘤的基礎(chǔ)。HIFU可將超聲聚焦，瞬間產(chǎn)生高溫，使腫瘤細胞發(fā)生不可逆的壞死，療效確切，但存在腫瘤消滅不完全、術(shù)后易復(fù)發(fā)等缺點。謝輝等[4]采用HIFU治療裸鼠肝移植瘤，消融80%的皮下移植瘤后，再將連接磷脂酰肌醇蛋白多糖3(glypican-3, GPC3)抗體、并攜HSV-TK基因的納米級超分子探針的微泡靶向釋放于殘瘤中，記錄移植瘤中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)及微血管密度(microvessel density, MVD)的變化，發(fā)現(xiàn)微泡+HSV-TK+GPC3組的VEGR、HIF-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低；且腫瘤組織中毛細血管生成受到抑制、MVD水平明顯降低，使腫瘤血供受限，從而導(dǎo)致腫瘤缺血壞死。李炯等[5]分析超聲微泡聯(lián)合GPC3抗體及HSV-TK在體外對人肝癌細胞株增殖及侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)超聲輻照孵育48 h后載基因靶向微泡組轉(zhuǎn)染率明顯增高，而肝癌細胞中增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表達及侵襲細胞數(shù)明顯降低，載基因靶向微泡組的細胞凋亡率達49%。

體外合成或基因表達產(chǎn)生的凋亡素可引導(dǎo)多種惡性腫瘤細胞凋亡，但對人體正常二倍體細胞無作用。張園等[6]通過UTMD聯(lián)合半乳糖聚乙烯亞胺(galactosylated-polyethylenimine, PEL-Gal)介導(dǎo)凋亡素基因，探討其對小鼠肝癌移植瘤的影響，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織凋亡率顯著增高，Caspase-3蛋白表達顯著增加，抑制腫瘤細胞凋亡的Bal-2蛋白表達明顯下降。

實驗研究[7-8]發(fā)現(xiàn)癌胚蛋白GPC3及Hippo信號通路核心效應(yīng)因子Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein, YAP)的表達與HCC的產(chǎn)生、發(fā)展、凋亡和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。潘青云等[9]觀察超聲輻照攜帶miR-520c-3p和miR-132微泡轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人肝癌細胞，發(fā)現(xiàn)miR-520c-3p僅能抑制GPC3mRNA蛋白的翻譯過程，引起YAP蛋白及其mRNA表達減少；而miR-132僅能抑制YAP蛋白及其mRNA表達，但對GPC3無影響；以超聲輻照攜miR-520c-3p及miR-132微泡組，48 h后其細胞增殖率及凋亡率明顯低于其余各組，提示其能顯著抑制人肝癌細胞株增殖，并促進其凋亡，其機制可能與GPC3與YAP表達的調(diào)節(jié)有關(guān)。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)與HCC患者預(yù)后不良有關(guān)，而被TGF-β活化的長鏈非編碼RNA(lncRNA activated by TGF-β, lncRNA-ATB)是TGF-β信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。同時，lncRNA-ATB還能競爭性地與miR-200結(jié)合，增加E盒結(jié)合鋅指蛋白(E-box binding zinc finger protein, ZBE)1和2的表達，從而引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和遷移，導(dǎo)致癌癥進展和轉(zhuǎn)移。Chen等[10]通過UTMD使lncRNA-ATB沉默RNA(siATB)轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株48 h，與對照組相比，siATB+UTMD組ZEB1及ZEB2的RNA及蛋白質(zhì)均明顯受到抑制，同時肝癌細胞的遷移與擴散也明顯減少。而與siRNA相比，短發(fā)夾RNA(shRNA)更加穩(wěn)定。JKN信號途徑也參與某些疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，同時與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。張宇虹等[11]通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與UTMD技術(shù)結(jié)合，分析JKN1 shRNA對小鼠肝癌細胞株的影響，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體+超聲微泡+超聲輻照組的轉(zhuǎn)染率均大于其余各組，提示肝癌細胞株JKN1表達明顯受到抑制。CD133是肝癌干細胞(Liver cancer stem cells, LCSCs)的表面標記物，能在EMT過程中發(fā)揮作用，同時也是決定HCC發(fā)生和總生存期的重要因素。Liu等[12]通過UTMD介導(dǎo)shCD133來分析CD133和EMT在LCSCs中的調(diào)節(jié)機制，發(fā)現(xiàn)通過核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)途徑抑制LSCSs中的CD133可以逆轉(zhuǎn)EMT，起到抑制腫瘤增殖轉(zhuǎn)移的作用；UTMD體外轉(zhuǎn)染CD133陽性亞群肝癌細胞組內(nèi)球狀細胞明顯減少，提示shCD133可抑制肝癌細胞自我更新。

Xue等[13]使用effectene轉(zhuǎn)染劑結(jié)合UTMD介導(dǎo)shRNA-Sox9轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株，發(fā)現(xiàn)effectene+shRNA-SOX9+UTMD組轉(zhuǎn)染率明顯高于其余組，Sox9的表達明顯減少，提示其能顯著抑制肝癌細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

2.2肝纖維化(hepatic fibrosis, HF) 肝細胞受到慢性損傷時，肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)是激活HF的中心環(huán)節(jié)。HF長期持續(xù)可轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不?liver cirrhosis, LC)，其發(fā)病率和死亡率均較高[14]。微泡介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可為治療HF提供新的可能[15]。

2.2.1基質(zhì)蛋白金屬酶(Matrix metalloproteinases, MMPs) MMPs可降解細胞外多數(shù)基質(zhì)成分，有效緩解HF。田力等[16]通過RNAi技術(shù)構(gòu)建定點干擾基質(zhì)蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)表達的病毒表達載體，并用超聲微泡攜TIMP-1 siRNA，以UTMD技術(shù)轉(zhuǎn)染后，實驗組肝組織內(nèi)TIMP-1、TIMP mRNA含量明顯低于模型對照組，MMP含量顯著上升，大鼠HF得到一定緩解。

2.2.2肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF) HGF能調(diào)節(jié)膠原纖維合成與炎性反應(yīng)，抑制HSC活性，從而阻止HF發(fā)展[17]。Jiang等[18]通過超聲微泡介導(dǎo)HGF基因轉(zhuǎn)染肝臟，發(fā)現(xiàn)超聲-微泡-HGF組丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)含量明顯降低，而總蛋白(total protein, TP)含量明顯升高，提示大鼠HF受到抑制，肝臟功能得到改善，蛋白質(zhì)合成增加。夏國園等[19]研究報道，在一定范圍內(nèi)，HGF對肝纖維化的抑制作用隨治療劑量加大而增加。李文艷等[20]制備出質(zhì)微泡-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物(LMB-CNLP)，使其攜HGF基因，并給予超聲輻照，探討其對處于對數(shù)生長期的HSC株的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下可觀察到LMB-CNLP組熒光較多，轉(zhuǎn)染144 h后LMB-CNLP組轉(zhuǎn)染率為41.29%，HSC-T6凋亡率達32.81%，可為治療HF提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

2.2.3結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF) CTGF被認為是基因干擾HF的潛在靶點[21-22]。楊丹等[23]采用搭載CTGF-miRNA的陽離子脂質(zhì)體微泡，轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下已可見較多綠色熒光；載基因陽離子脂質(zhì)體-微泡聯(lián)合超聲組的細胞活性與其他組差異無統(tǒng)計學意義，而轉(zhuǎn)染效率明顯高于其他組，表明該基因轉(zhuǎn)染方法具有安全性，也為基因干擾治療HF提供了新思路。

2.3乙型肝炎 我國每年約有100萬人死于由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)所致肝衰竭、LC和肝癌[24]?？桂げ《镜鞍譇(myxovirus resistant A, MxA)對HBV等的抗病毒活性較敏感[25]。劉愛平等[26]以超聲輻照在小白鼠肝臟處靶向表達MxA基因，與其余組相比，超聲+微泡+質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組肝組織內(nèi)可見大量MxA表達陽性細胞。Ndc80是細胞分裂的相關(guān)基因，Ndc80高表達可促進細胞增殖。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)Ndc80在HCC組織中的表達增加，而在由HBV引起的HCC中增加更為顯著；進一步研究顯示，與對照組相比，敲除Ndc80基因的細胞可有效抑制HBV復(fù)制，同時也能抑制與HBV相關(guān)HCC。

3 小結(jié)與展望

UMCG安全性高，靶向性好，轉(zhuǎn)染率高，應(yīng)用前景十分廣闊，可為診療許多疾病提供新的思路和方法。但目前多數(shù)研究仍處于實驗階段，且許多基因治療疾病的機制尚不明確，有待進一步觀察。