條件重編程細(xì)胞在腫瘤治療中的研究進展

據(jù)國家癌癥中心數(shù)據(jù)統(tǒng)計，中國惡性腫瘤發(fā)病率為380.4萬/年，癌癥已成為中國乃至全球主要的死亡原因，給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。癌癥是一種高度異質(zhì)性的疾病。近年來高通量測序技術(shù)不僅闡明了多種癌癥的突變過程，而且提供了一個全面的癌癥基因目錄［1］，目前基因組分析和靶向治療已經(jīng)應(yīng)用到幾乎所有類型的腫瘤治療，但隨之出現(xiàn)腫瘤耐藥性、耐藥的原因以及新型腫瘤藥物的研發(fā)已經(jīng)成為臨床重點關(guān)注的問題。迄今為止，傳統(tǒng)建立的腫瘤細(xì)胞系一直是細(xì)胞、分子和癌癥生物學(xué)的支柱，然而腫瘤細(xì)胞系經(jīng)長期體外培養(yǎng)后，其生物學(xué)行為及基因譜表達(dá)水平、腫瘤異質(zhì)性都與原始腫瘤組織存在較大的差異，不能準(zhǔn)確地反映原始腫瘤異質(zhì)性和腫瘤細(xì)胞微環(huán)境等特點，因此不適用于篩選臨床新型化療藥物，以及對腫瘤患者進行個體化治療。

Liu等［2］提出條件重編程細(xì)胞（conditional repro?grammed cells，CRCs）可在實驗室中無限制培養(yǎng)出正常的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。CRCs的培養(yǎng)方法較多，不同組織來源的細(xì)胞培養(yǎng)方法不同，本文主要研究CRC在Rho激酶抑制劑（Y?27632）存在的情況下，將經(jīng)輻射過的小鼠成纖維細(xì)胞Swiss 3T3 J2作為飼養(yǎng)細(xì)胞與正常和腫瘤的人上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的技術(shù)。該技術(shù)高度保留腫瘤細(xì)胞的基因型和表現(xiàn)型、瘤細(xì)胞的特征，有助于腫瘤模型的構(gòu)建。本文就CRCs在腫瘤治療中的研究進展及應(yīng)用前景進行綜述。

1 CRCs與其他細(xì)胞培養(yǎng)方法比較

眾所周知，體內(nèi)的細(xì)胞在自然狀態(tài)下很難在體外保持長期增殖活力。目前有幾種實現(xiàn)永生化的方法。最常見的方法是利用病毒致癌基因來改造宿主細(xì)胞的基因組，如SV40的大型T抗原32以及乳頭瘤病的E6/E7蛋白；或者在基因組植入人類的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）33和cdk4，然而這些遺傳操作導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，使得體外傳代若干次后，關(guān)鍵生物學(xué)和遺傳特質(zhì)發(fā)生不可逆的損失［2］。大多數(shù)原代細(xì)胞，無論培養(yǎng)方式有何差異，都難以維持體外增殖，最終邁向衰亡［3］。iPSC或ES均可在體外繁殖并保留正常核型，在再生醫(yī)學(xué)中顯示出巨大的潛力［4］，然而，如何精確的將其分化成特定的組織目前尚難以做到，某種程度上，使用人體ES細(xì)胞違背倫理學(xué)的要求，且iPSC需要轉(zhuǎn)入可以改變細(xì)胞生長和分化特性的外源性基因［5］，另外，這些方法的效率相對較低。近年來，人源性腫瘤移植瘤模型（patient?derived xenograft，PDX）逐漸成為藥物研發(fā)過程中臨床前藥物的首選篩選工具［6］。PDX模型能夠保留原始腫瘤組織絕大部分生物學(xué)特性及重要的遺傳信息，較高程度地反映原始腫瘤復(fù)雜的異質(zhì)性與分子多樣性，在某些情況下已被證明可以預(yù)測治療反應(yīng)。然而，由于其成瘤率低且不穩(wěn)定、建模時間長、不能用于篩選免疫相關(guān)類藥物、價格昂貴、很難建立高通量平臺等諸多不足，仍需要大量科學(xué)研究進行解決。

類器官［7］能準(zhǔn)確模擬體內(nèi)上皮結(jié)構(gòu)并能夠表現(xiàn)出細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，具有穩(wěn)定的表型和遺傳學(xué)特征，可作為篩選藥物的新途徑，開辟了基因和干細(xì)胞治療疾病的新途徑。盡管類器官的前景廣闊，但需要大量起始細(xì)胞，不適于高通量篩選，而且經(jīng)常呈現(xiàn)出較低的體外活力以及缺乏血管。

相比上述方法，CRCs能夠維持腫瘤組織和正常組織體外無限期增殖，研究表明其能保持組織核型及遺傳物質(zhì)不受改變，即CR細(xì)胞和患者腫瘤組織在病理學(xué)、基因組學(xué)保持一致，并且保留腫瘤細(xì)胞完全分化的能力。CR細(xì)胞可用于診斷和預(yù)測醫(yī)學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、藥物敏感性測試、基因表達(dá)譜分析和異種移植研究等方面。

2 CRCs的培養(yǎng)條件

2.1 CRCs的“飼養(yǎng)者”—輻射后的Swiss?3T3 J2小鼠纖維原細(xì)胞

CRCs是一種在Rho激酶抑制劑（Y?27632）存在的情況下，將輻射過小鼠成纖維細(xì)胞Swiss 3T3 J2作為飼養(yǎng)細(xì)胞、與正常和腫瘤的上皮細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)。在培養(yǎng)基中加入Swiss 3T3 J2充當(dāng)組織細(xì)胞“飼養(yǎng)者”。使用輻射過的小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的上皮細(xì)胞幾乎以恒定的速率生長，輻射是實現(xiàn)永生化的重要因素，并且是刺激飼養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生和/或釋放生長因子的必須因素。其次，飼養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)基中釋放生長因子，誘導(dǎo)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）活性，從而促進細(xì)胞的無限期增殖。hTERT是細(xì)胞永生化的關(guān)鍵因素。Palechor?Ceron等［8］證明在含有飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中，存在或缺少Y?27632，hTERT的表達(dá)顯著高于不含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，而且Y?27632在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下不會永生化。飼養(yǎng)細(xì)胞釋放的生長因子是如何實現(xiàn)誘導(dǎo)hTERT的表達(dá)目前仍是未知。飼養(yǎng)細(xì)胞促進條件重編程永生化并不需要直接的物理接觸，即飼養(yǎng)細(xì)胞釋放的生長因子與Y?27632相配合，從而促進上皮細(xì)胞的增殖和存活。

2.2 ROCK（Rho激酶）抑制劑Y?27632

Watanabe等［9］發(fā)現(xiàn)Y?27632能增加人胚胎干細(xì)胞的克隆效率與角質(zhì)細(xì)胞干細(xì)胞的活力。Chapman等［10］提出與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)時，Y?27632誘導(dǎo)細(xì)胞可無限期增殖。該研究表明，飼養(yǎng)細(xì)胞與Y?27632誘導(dǎo)細(xì)胞無限增殖的能力與HPV?16 E6和E7致癌基因相似。E6和飼養(yǎng)細(xì)胞均可以激活端粒酶活性［11］，E7和Y?27632均破壞了肌動蛋白/肌球蛋白骨架［12］，并且可以使Rho激酶失活；表明Y?27632可能干擾P16/Rb途徑，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。Suprynowicz等［13］發(fā)現(xiàn)Y?27632可以明顯增強上皮干細(xì)胞標(biāo)記物ΔNp63α和CD?44的表達(dá)，同時減少Notch?1表達(dá)，與飼養(yǎng)細(xì)胞結(jié)合后，Y?27632又可以增加α6和β1整合素以及β?連環(huán)蛋白的表達(dá)，且這種干性表達(dá)是廣泛表達(dá)；Y?27632可以增強角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖并抑制其分化［11］；缺乏Y?27632和飼養(yǎng)細(xì)胞時，人包皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HFKS）的增殖明顯減少，相反Y?27632明顯刺激細(xì)胞的增殖，與Y?27632和飼養(yǎng)細(xì)胞存在的情況下增殖情況相似，表明Y?27632可直接作用于HFKs，其主要通過抑制鈣和血清誘導(dǎo)的分化來促進增殖，這種增殖只是暫時的，在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，不能實現(xiàn)HFKS的無限增殖；進一步研究又發(fā)現(xiàn)，Y?27632不能增強飼養(yǎng)細(xì)胞的生長因子的釋放。

總之，目前CRCs促進細(xì)胞永生化的機制尚研究中。飼養(yǎng)細(xì)胞與Y?27632在F培養(yǎng)基中誘導(dǎo)細(xì)胞無限增殖的兩個主要功能主要通過：1）誘導(dǎo)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性；2）細(xì)胞骨架重塑和/或干擾P16/Rb途徑。

3 CRCs的臨床應(yīng)用

CRCs允許從各種組織類型建立患者衍生的正常和腫瘤上皮細(xì)胞，培養(yǎng)無法在體外增殖但又具有重要生理功能的細(xì)胞，如肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar typeⅡ，ATⅡ）等，有助于深入探討其生理功能及相關(guān)病理過程。CRCs具有分化成起源組織的能力，當(dāng)前列腺組織重編程細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠的腎小囊下時，可分化成良好的前列腺上皮。氣管支氣管組織CRCs在體外可分化成纖毛細(xì)胞和黏膜細(xì)胞。

利用CRCs不僅可以發(fā)現(xiàn)新的疾病治療方法，而且可以用于新藥研發(fā)。對于臨床上產(chǎn)生嚴(yán)重耐藥的惡性腫瘤患者，可以對其腫瘤CRCs進行基因突變檢測及藥物敏感性選擇，由此制定符合患者實際病情的個體化給藥方案。如Yuan等［14］利用CRCs建立了侵襲性復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭狀瘤患者的正常和腫瘤肺組織細(xì)胞培養(yǎng)物。該研究應(yīng)用基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)喉癌腫瘤細(xì)胞含有野生型7.9?kb人乳頭狀瘤病毒11型基因組，肺腫瘤細(xì)胞含有10.4?kb基因組。進一步利用藥物敏感性測試，確定伏立諾他胺作為特異性潛在的治療劑，臨床治3個月后，病灶開始縮小。Timofeeva等［15］利用培養(yǎng)出的前列腺正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，證明基底細(xì)胞群作為前列腺腫瘤的主要來源，同時說明CRCs在飼養(yǎng)細(xì)胞和Y?27632存在的條件下可維持高水平的增殖和低水平的分化，一旦置于體內(nèi)或模擬其自然環(huán)境的條件下可完全分化。研究者研究多西他賽對CRCs的敏感性，匹配的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的IC50值分別是1.79μm和0.29μm，這些數(shù)據(jù)可以說明匹配的正常和腫瘤細(xì)胞可用于患者的個體化治療或者用于發(fā)現(xiàn)新型藥物。Ringer等［16］發(fā)現(xiàn)新型CDK抑制劑VMY能誘導(dǎo)前列腺腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生p53依賴性自噬，進而促使細(xì)胞凋亡，結(jié)果亦在人前列腺癌CRCs上得到證實。在移植方面，通過獲得患者自身少量的細(xì)胞，使培養(yǎng)的CRCs按相應(yīng)器官的3D模型增殖，由此產(chǎn)生再生器官［11］。黎張燕等［17］利用CRCs技術(shù)建立肺癌體外培養(yǎng)體系，采用MTS方法檢測6例肺腺癌細(xì)胞對臨床常規(guī)化療藥物順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、長春瑞濱的敏感程度，結(jié)果顯示患者肺腺癌細(xì)胞整體對鉑類藥物敏感率高，而對長春瑞濱的敏感率低，與臨床情況具有一致性，也與之前的研究結(jié)果相似。目前，CRCs已被用于篩選新藥或發(fā)現(xiàn)新靶點［18］、靶向治療耐藥性肺癌的研究［19］和其他類型的上皮細(xì)胞研究［20?22］。CRCs可同時對腫瘤組織細(xì)胞和正常組織細(xì)胞進行無限增殖，是生物醫(yī)學(xué)界的重大發(fā)現(xiàn)，不僅可用來研究疾病機理及藥物敏感性測試，而且可實現(xiàn)體外培養(yǎng)復(fù)雜的器官，或?qū)⒊蔀樾碌乃幬锇l(fā)現(xiàn)平臺，從而實現(xiàn)真正的精準(zhǔn)醫(yī)療。

4 CRCs優(yōu)越性及缺陷

盡管CRCs操作過程簡單，短時間內(nèi)即可實現(xiàn)細(xì)胞無限增殖，而且保留細(xì)胞本身的基因型、表現(xiàn)型、永生化和分化的能力，具有可控性，但仍面臨較多問題。首先該方法實現(xiàn)細(xì)胞永生化和保留分化能力的機制仍不明確，還需要進一步的研究。其次輻射后的飼養(yǎng)細(xì)胞抑制了腫瘤相關(guān)基底細(xì)胞的過度生長，但是難以測定基底細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞生長的影響及其對腫瘤藥物的治療影響。在大量的實驗過程中，由于穿刺組織或手術(shù)組織中含有成纖維細(xì)胞，在培養(yǎng)物中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)混雜著成纖維細(xì)胞，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長。而且腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)?；祀s正常組織，在培養(yǎng)物中難以區(qū)別出正常的上皮細(xì)胞，從而進一步影響研究結(jié)果。最后，因為Y?27632可以改變肌動蛋白骨架，從而可能干擾腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力。

5 結(jié)語

綜上所述，條件重編程技術(shù)盡管機制尚不清楚、培養(yǎng)物不能完全純化、部分組織存在成纖維細(xì)胞、Y?27632影響腫瘤遷移和侵襲的測定等缺陷，但是這項活組織培養(yǎng)新技術(shù)能夠保留腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的基因型和表現(xiàn)型，實現(xiàn)細(xì)胞的無限期增殖，并且保持完全分化的能力，為腫瘤化療耐藥的患者提供可靠的細(xì)胞及體內(nèi)模型用于研究耐藥機制和篩選新型藥物，進一步實現(xiàn)肺癌患者的精準(zhǔn)醫(yī)療，同時有望為建立活生物庫、實現(xiàn)再生醫(yī)學(xué)以及開展新的癌癥研究提供基礎(chǔ)。