透骨消痛膠囊對(duì)兔膝骨質(zhì)疏松性骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨與軟骨下骨結(jié)構(gòu)的影響

張佳慧，陳賽楠，陳文列，黃云梅，林如輝，黃美雅，吳銀生，鄭良樸，李鉆芳，劉獻(xiàn)祥

【摘 要】目的：觀察透骨消痛膠囊對(duì)骨質(zhì)疏松性骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨與軟骨下骨結(jié)構(gòu)的影響，為探討治療該類(lèi)型骨關(guān)節(jié)炎提供依據(jù)。方法：將18只新西蘭大白兔分為正常組、模型組、中藥組。除正常組外，其余2組先誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松，再建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型。正常組與模型組給予生理鹽水，中藥組給予透骨消痛膠囊灌胃4周。HE和番紅-固綠染色，光鏡觀察軟骨結(jié)構(gòu)；顯微CT觀察軟骨下骨，分析骨小梁參數(shù)；掃描電鏡觀察軟骨下骨微細(xì)結(jié)構(gòu)。結(jié)果：模型組軟骨損傷，基質(zhì)蛋白多糖淺染，Mankin評(píng)分達(dá)中期損傷；軟骨下骨骨小梁結(jié)構(gòu)破壞，參數(shù)變化；膠原纖維等微細(xì)結(jié)構(gòu)損傷。中藥組軟骨損傷減輕，基質(zhì)深染，Mankin評(píng)分為早期損傷；軟骨下骨骨小梁結(jié)構(gòu)和參數(shù)改善；膠原纖維等微細(xì)結(jié)構(gòu)改善。結(jié)論：透骨消痛膠囊能改善骨質(zhì)疏松性骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨結(jié)構(gòu)與基質(zhì)病變，減輕軟骨下骨微結(jié)構(gòu)破壞，故可延緩該類(lèi)型骨關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；骨質(zhì)疏松性骨關(guān)節(jié)炎；透骨消痛膠囊；軟骨；軟骨下骨；兔

Intervention of Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛膠囊）in Cartilage and Subchondral Bone Structure of Rabbit Models with Osteoporotic Osteoarthritis in Knees

ZHANG Jia-hui，CHEN Sai-nan，CHEN Wen-lie，HUANG Yun-mei，LIN Ru-hui，HUANG Mei-ya，WU Yin-sheng，

ZHENG Liang-pu，LI Zuan-fang，LIU Xian-xiang

【ABSTRACT】Objective：To observe the effects of Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛膠囊）on cartilage

and subchondral bone structure of rabbit models with osteoporotic osteoarthritis in knees to provide the basis for the treatment of this type of osteoarthritis.Methods：Eighteen New Zealand white rabbits were divided into a normal group，a model group and a Chinese medicine group.Except for the normal group，osteoporosis were induced in the other two groups to establishing models with knee osteoarthritis.The normal group and the model group were given normal saline，while the Chinese medicine group was given intragastric administration of Tougu Xiaotong Jiaonang for 4 weeks.After HE and safranine fast green staining，the cartilage structure was observed under the light microscopy.Micro CT was used to observe the subchondral bone to analyze the trabecular bone parameters.The subchondral bone microstructure was observed with scanning electron microscope.Results：In the model group，the cartilage was damaged，the matrix proteoglycan was understained，and Mankin score showed the medium-term injury.The subchondral bone trabecular structure was destructed and the parameter changed.Fine structures such as collagen fiber were damaged.In the Chinese medicine group，the cartilage damage was relieved，the matrix was deeply stained，and the Mankin score showed early damage.The trabecular bone structure and parameters were improved.The collagen fiber and other fine structures were also improved.Conclusion：Tougu Xiaotong Jiaonang can improve the cartilage structure and matrix lesions in models with osteoporotic osteoarthritis and reduce the damage to subchondral bone microstructure to delay the pathological process of this type of osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis；osteoporotic osteoarthritis；Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛膠囊）；cartilage；endprint

subchondral bone；rabbits

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的特征為軟骨變性、軟骨下骨破壞、骨贅增生等[1]。骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）表現(xiàn)為骨強(qiáng)度受損、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞、骨脆性增加[2]。臨床上存在OP性O(shè)A，其特征是軟骨下骨疏松易脆，被持續(xù)增加骨重塑誘導(dǎo)并導(dǎo)致軟骨下微骨折和磨損，從而加速OA發(fā)展，而且隨著年齡增加，OP性O(shè)A發(fā)生率不斷增加[3-4]。目前的研究較少關(guān)注OP性O(shè)A，大多數(shù)研究?jī)H集中在OA的軟骨結(jié)構(gòu)變化或OP的軟骨下骨結(jié)構(gòu)變化[5-6]。而關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨之間又存在密切的生物力學(xué)關(guān)系，軟骨下骨的力學(xué)性能可影響關(guān)節(jié)軟骨的完整性，引發(fā)軟骨退變[7-8]。因此，研究OP性O(shè)A中軟骨和軟骨下結(jié)構(gòu)變化具有重要意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，OA與OP兩者均以腎虛為本，均是全身退行性改變，補(bǔ)腎法能夠有效治療OA和OP[9]。透骨消痛膠囊由巴戟天、白芍、川芎、腫節(jié)風(fēng)組成，具有補(bǔ)腎柔肝、活血祛風(fēng)等功效，長(zhǎng)期用于臨床治療OA療效顯著[10]。前期研究表明，透骨消痛膠囊能減輕軟骨損傷[11]，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和骨鈣素的分泌[12]；能改善軟骨下骨重塑和硬化[13]。故根據(jù)腎虛是OA和OP的共同病機(jī)，該藥對(duì)OP性O(shè)A也可能有藥效作用，但對(duì)OP性O(shè)A干預(yù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)透骨消痛膠囊干預(yù)OP性O(shè)A模型，觀察軟骨與軟骨下骨結(jié)構(gòu)變化，為探索在臨床上使用該藥治療OP性O(shè)A的可能性提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18只6月齡普通級(jí)雌性新西蘭大白兔，體質(zhì)量1.8～2.1 kg，由上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0011。動(dòng)物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2009-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和儀器 透骨消痛膠囊（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，閩制字Z20100006）；光學(xué)顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）；小動(dòng)物顯微CT（廣州中科愷盛醫(yī)療科技有限公司）；臺(tái)式掃描電鏡（日本日立高新技術(shù)公司）。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組與模型制備 將18只新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥組，每組6只。除正常組外，其余2組以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的戊巴比妥鈉按30 mg·kg-1劑量耳緣靜脈注射麻醉，手術(shù)切除雙側(cè)卵巢誘導(dǎo)OP[14]。4周后，采用改良Hulth法[15]建立右膝OA模型，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，完整摘除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶。手術(shù)后1周，每日強(qiáng)迫動(dòng)物活動(dòng)30 min，連續(xù)4周，建立OP性O(shè)A模型。

2.2 動(dòng)物給藥與取材 OP性O(shè)A模型建立后，中藥組用透骨消痛膠囊1.86 g·kg-1·d-1灌胃，正常組與模型組用等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)4周。用藥結(jié)束后，采用空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取右膝股骨、脛骨，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛中。

2.3 軟骨HE染色觀察 股骨經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定3 d，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的EDTA脫鈣16周，取股骨內(nèi)髁沿矢狀面切開(kāi)，再用乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋。石蠟切片4 μm，脫蠟至水，蘇木素染色30 min，分化，伊紅速染1 s，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察軟骨組織病理變化、攝影。

2.4 軟骨番紅-固綠染色觀察 股骨切片脫蠟，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的番紅染色10 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的固綠染色3 min，體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇分化3 s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的番紅復(fù)染3 min，透明、封片，光鏡觀察、攝影。

2.5 軟骨Mankin評(píng)分 根據(jù)HE染色、番紅-固綠染色，參照Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[16]，評(píng)估軟骨病變程度，根據(jù)軟骨表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞排列、番紅染色程度、潮線完整性等進(jìn)行病程分期，1～5分為早期OA，6～9分為中期OA，10～14分為晚期OA。

2.6 軟骨下骨Micro-CT觀察 經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定的脛骨，置于Micro-CT檢查槽，沿脛骨長(zhǎng)軸方向掃描，條件為電壓60 KV、電流666 μA、功率40 W，分辨率50 μm，掃描30 min，

圖像二值化。掃描圖片后三維重建，分別觀察軟骨下骨脛骨平臺(tái)、矢狀面、橫斷面，并選擇脛骨軟骨下骨相同圖像位置的感興趣區(qū)域，進(jìn)行骨小梁參數(shù)分析，包括骨密度（BMD）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）。

2.7 軟骨下骨掃描電鏡觀察 Micro-CT觀察后，于脛骨內(nèi)側(cè)1/3處用刀片斷開(kāi)；先后用PBS、蒸餾水充分清洗骨髓腔，再用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%、100%的叔丁醇脫水，真空干燥后將樣本定向固定于載物臺(tái)，臺(tái)式掃描電鏡下觀察。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，正態(tài)性分布采用單因素方差分析，方差齊采用LSD檢驗(yàn)；非正態(tài)性分布采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨顯微結(jié)構(gòu) 正常組軟骨表面光滑平整，細(xì)胞數(shù)量較多，排列整齊。模型組軟骨表面粗糙有裂隙、纖維增多，細(xì)胞數(shù)量彌漫性增多，有簇集樣細(xì)胞團(tuán)，排列混亂。中藥組軟骨損傷程度較模型組輕，表面較光滑，細(xì)胞排列較整齊，數(shù)量略增加。見(jiàn)圖1。

3.2 軟骨蛋白多糖 番紅能與酸性蛋白多糖結(jié)合，將軟骨基質(zhì)染成粉紅色；固綠可與含堿性氨基酸的膠原纖維結(jié)合將軟骨下骨染成藍(lán)綠色[17]。正常組軟骨基質(zhì)被染成均勻粉紅色，蛋白多糖較豐富；軟骨放射層與鈣化層交界的潮線清晰可見(jiàn)；軟骨下骨膠原纖維被染成藍(lán)綠色，鈣化層與軟骨下骨板分界的黏合線清晰，呈鋸齒狀。模型組軟骨基質(zhì)番紅染色重度減退，蛋白多糖較少；可見(jiàn)潮線不齊；黏合線呈波浪狀。中藥組軟骨基質(zhì)番紅染色加深，甚至深于正常組，蛋白多糖豐富；潮線可見(jiàn)；黏合線也呈波浪狀。見(jiàn)圖2。endprint

3.3 3組軟骨Mankin評(píng)分比較 與正常組比較，模型組Mankin評(píng)分增加（P < 0.01），表明軟骨損傷增加，屬于中期OA；與模型組比較，中藥組Mankin評(píng)分降低（P < 0.05），表明軟骨損傷減輕，為早期OA。見(jiàn)表1。

3.4 軟骨下骨微結(jié)構(gòu)Micro-CT觀察 從脛骨平臺(tái)結(jié)構(gòu)三維重建圖可見(jiàn)，正常組脛骨平臺(tái)表面平整、光滑，未見(jiàn)骨贅形成。模型組脛骨平臺(tái)表面粗糙不平，邊緣有骨贅凸起。中藥組脛骨平臺(tái)表面不平整，邊緣有比模型組小的骨贅。見(jiàn)圖3。

從矢狀面結(jié)構(gòu)三維圖可見(jiàn)，正常組軟骨下骨骨小梁排列整齊、連接性好；骺端Tb.N較多。模型組軟骨下骨骨小梁排列混亂，間距較大，部分?jǐn)嗔?；骺端骨小梁大量消失。中藥組軟骨下骨骨小梁排列較為整齊、均勻；骺端Tb.N較模型組增加。見(jiàn)

圖4。

從橫斷面二維圖可見(jiàn)，正常組骨小梁從四周向中部排列均勻有序，呈均勻網(wǎng)狀交織結(jié)構(gòu)。模型組邊緣骨小梁排列無(wú)序紊亂，局部致密增生，部分扭曲斷裂，邊緣有骨贅。中藥組骨小梁排列較整齊，局部骨小梁少量增加，無(wú)明顯斷裂，連接性較好，仍可見(jiàn)交織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，邊緣一側(cè)有部分骨贅，骨小梁結(jié)構(gòu)較模型組改善，接近正常組結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖5。

3.5 3組軟骨下骨骨小梁參數(shù)比較 與正常組比較，模型組BMD、Tb.Th和BV/TV顯著降低（P < 0.05

或P < 0.01），Tb.N、Tb.Sp均發(fā)生變化；與模型組比較，中藥組的BV/TV顯著增加（P < 0.05），BMD、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp改善，且較接近正常組水平。見(jiàn)表2。

3.6 軟骨下骨微細(xì)結(jié)構(gòu)掃描電鏡觀察 從骨小梁結(jié)構(gòu)圖可見(jiàn)，正常組軟骨下骨骨小梁呈不規(guī)則立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，連接性好，未見(jiàn)明顯斷裂，與軟骨下骨板連接處結(jié)構(gòu)完整，能起到吸收應(yīng)力作用。模型組軟骨下骨骨小梁部分?jǐn)嗔选⑹杷?，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，吸收應(yīng)力作用減弱。中藥組骨小梁結(jié)構(gòu)較模型組改善，未見(jiàn)明顯斷裂，仍可見(jiàn)部分網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與軟骨下骨板連接處較為完整，能起到一定的吸收應(yīng)力作用。見(jiàn)圖6。

從膠原纖維結(jié)構(gòu)圖可見(jiàn)，正常組斷面較光滑，膠原纖維及其結(jié)合的鈣-磷等骨鹽致密緊實(shí)。模型組斷面粗糙，膠原纖維及骨鹽松散且有裂隙。中藥組斷面較光滑，膠原纖維間致密但有裂隙。見(jiàn)圖7。

4 討 論

在中醫(yī)學(xué)中OA屬“骨痹”范疇，OP屬“骨痿”范疇，病位均在骨，為腎臟所主，而肝腎兩臟關(guān)系密切，因此兩者的病機(jī)都是肝腎虧虛[18]。從西醫(yī)學(xué)來(lái)看，中醫(yī)的腎還關(guān)系著分泌、代謝、免疫等功能，對(duì)人體生長(zhǎng)、發(fā)育有重要調(diào)節(jié)作用；臨床上使用補(bǔ)腎中藥治療OP性O(shè)A，具有提高骨密度、改善疼痛等作用[9]。因此，本研究使用補(bǔ)腎柔肝中藥透骨消痛膠囊干預(yù)OP性O(shè)A，可為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)于OP性O(shè)A模型的造模方法，曾報(bào)道通過(guò)雙側(cè)卵巢切除術(shù)并增加皮質(zhì)類(lèi)固醇誘導(dǎo)OP模型后，再切斷前交叉韌帶和摘除內(nèi)側(cè)半月板手術(shù)誘導(dǎo)OA，建立復(fù)合模型[8]，但皮質(zhì)類(lèi)固醇可能會(huì)導(dǎo)致軟骨損傷[19]。因此，我們采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)和膝關(guān)節(jié)手術(shù)的造模方法[14，20]誘導(dǎo)OP性O(shè)A

模型。

軟骨退變是OA最主要的病理變化，基質(zhì)中蛋白多糖能吸引水分子嵌在構(gòu)成軟骨網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的膠原中，保持軟骨的黏彈性；OP性O(shè)A發(fā)生時(shí)，膠原降解，蛋白多糖減少，引起軟骨細(xì)胞功能改變，導(dǎo)致軟骨退變[14，21]。研究顯示，透骨消痛膠囊能明顯增加蛋白多糖，甚至高于正常組，這表明中藥可能是通過(guò)促進(jìn)蛋白多糖的合成分泌，改善軟骨基質(zhì)成分，維持軟骨細(xì)胞正常生存環(huán)境，并保持軟骨黏彈性，從而有利于軟骨修復(fù)，改善軟骨結(jié)構(gòu)，減輕軟骨損傷，延緩軟骨退變，從而使中期OA減輕至早期。

軟骨下骨可分為軟骨下骨板和骨小梁兩部分。軟骨下骨板是薄的皮質(zhì)骨，位于鈣化軟骨深處；骨小梁彼此連接形成網(wǎng)狀，起吸收應(yīng)力、緩沖震蕩和支撐作用[22]。骨小梁的穩(wěn)定性和強(qiáng)度與其微結(jié)構(gòu)的形態(tài)有關(guān)，如骨小梁的形態(tài)、連接方式和膠原纖維的走向、排列等[23]。模型組軟骨下骨膠原纖維粗糙松散，骨小梁疏松、斷裂，骨小梁參數(shù)分析顯示骨量降低，說(shuō)明該區(qū)域?qū)箼C(jī)械壓力降低，并顯示出較明顯畸形，導(dǎo)致機(jī)械性能改變，這可能與卵巢切除后雌激素水平下降、骨轉(zhuǎn)換率升高、骨吸收增加有關(guān)。

中藥組與模型組相比，膠原纖維致密緊實(shí)，骨小梁排列較有序，骨小梁參數(shù)分析顯示骨量增加等，說(shuō)明透骨消痛膠囊能抑制OP性O(shè)A軟骨下骨OP，改善軟骨下骨機(jī)械性能。這可能與中藥抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成，促進(jìn)膠原纖維的修復(fù)，改善軟骨下骨骨小梁的微結(jié)構(gòu)，從而維持其吸收應(yīng)力作用，與恢復(fù)軟骨下骨生物力學(xué)作用有關(guān)。軟骨下骨參數(shù)改善若要全部達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能需延長(zhǎng)治療時(shí)間，或是提前給藥。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨改變、軟骨下骨與軟骨之間的相互作用，在OP性O(shè)A中有著重要作用[14]。軟骨下骨結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致機(jī)械荷載應(yīng)力的變化，會(huì)將更多的負(fù)荷傳遞給上面的軟骨，導(dǎo)致軟骨損傷和退變進(jìn)一步加重[22]。軟骨下骨OP，會(huì)使得骨組織微骨折增加，反復(fù)多次微骨折會(huì)損傷骨組織機(jī)械性能，使生物力學(xué)強(qiáng)度下降，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生損傷[24]，最終加速OP性O(shè)A發(fā)展。透骨消痛膠囊可能通過(guò)改善軟骨下骨結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能，減輕過(guò)度負(fù)荷傳遞給上面軟骨，從而延緩軟骨退變。

綜上所述，透骨消痛膠囊一方面通過(guò)促進(jìn)蛋白多糖合成分泌，減輕軟骨結(jié)構(gòu)損傷，延緩軟骨退變；另一方面通過(guò)改善軟骨下骨膠原纖維、骨小梁的微結(jié)構(gòu)，提高骨量，改善軟骨下骨的結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能，反過(guò)來(lái)又減輕軟骨下骨上方軟骨的負(fù)荷，保護(hù)軟骨。本研究結(jié)果說(shuō)明，透骨消痛膠囊可改善兔膝OP性O(shè)A的軟骨和軟骨下骨結(jié)構(gòu)，維持其機(jī)械性能、延緩病理進(jìn)程，提示可在臨床上擴(kuò)展用于治療OP性O(shè)A，并可用于預(yù)防性用藥防止因OP導(dǎo)致的OA形成與發(fā)展。

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收稿日期：2017-06-14；修回日期：2017-08-03endprint