低苯丙氨酸花生肽混合物的制備

李志剛LI Zhi-gang 光翠娥, -, 干建平 -

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 黃岡師范學(xué)院經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室&大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)是一種由苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)代謝過程中的輔酶四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)缺乏或苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)活性喪失或合成不足，導(dǎo)致Phe無法被正常代謝[1]的常見隱性遺傳氨基酸代謝癥?，F(xiàn)階段推薦通過飲食管理達到治療的目的，即控制患者每日飲食攝入的Phe[2-3]。在采取普通嚴(yán)格低蛋白飲食時，患者可能會出現(xiàn)如不飽和脂肪酸、維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)素缺乏癥[4-6]，因此推薦食用低苯丙氨酸特殊醫(yī)學(xué)配方食品補充患者每日所需蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)素。目前，此類特膳食品主要為低/無苯丙氨酸游離氨基酸配方食品[7-8]。但此類特膳食品適口性差，存在由于攝入過多游離氨基酸而致腹瀉的風(fēng)險[8]。通過蛋白酶水解天然蛋白，分離Phe后所得低苯丙氨酸肽混合物可用于為PKU患者制備特殊醫(yī)學(xué)配方食品[9]。

目前，制備低苯丙氨酸肽混合物的原料主要以乳清蛋白[10-12]和酪蛋白[7,13]等動物性蛋白為主，而對植物蛋白的開發(fā)利用主要以不含過敏源的玉米蛋白[14]、小麥蛋白[15]及大米蛋白[16]為原料。由于花生蛋白含有大分子過敏性蛋白[9]限制了對其的開發(fā)利用，針對這一現(xiàn)狀，本研究通過多酶分步深度降解花生蛋白，再利用活性炭吸附分離Phe制備不含過敏性蛋白的低苯丙氨酸肽混合物，一方面為花生蛋白的應(yīng)用提供新方向，另一方面為將來制備適合PKU患者食用的特殊醫(yī)學(xué)配方食品提供更多的原料選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

花生蛋白：粗蛋白含量73.69%，陜西森弗天然制品有限公司；

Alcalase2.4L：食品級，19 8761 U/mL，諾維信(中國)投資有限公司；

Flavourzyme：食品級，38 810 U/mL，諾維信(中國)投資有限公司；

木瓜蛋白酶：食品級，169 704 U/g，廣西龐博生物工程有限公司；

三氯乙酸、氫氧化鈉、濃鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等：分析純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

粉末活性炭：食品級，200目，椰殼制，江蘇森森碳業(yè)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：EL204型，PL20002型，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

pH計：FE-20型，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

紫外可見光分光光度計：UV-1600型，上海美普達儀器有限公司；

電熱恒溫水槽：DK-8D型，上海精宏實業(yè)有限公司；

氨基酸專用高效液相色譜儀：Agilent1100型，美國安捷倫科技有限公司；

高效液相色譜儀：Waters600型，美國沃特世有限公司。

1.2 方法

1.2.1 游離Phe含量測定及氨基酸組成分析 采用OPA柱前衍生高效液相色譜—紫外檢測法。

(1) 色譜條件：色譜柱：Agilent Hypersil ODS柱(5 μm，4.0 mm×250 mm)；梯度洗脫程序：0 min，8%；17 min，50% B；24.0 min，0% B；流動相A(pH=7.2)：27.6 mmol/L醋酸鈉—三乙胺—四氫呋喃(體積比為500∶0.11∶2.5)；流動相B(pH=7.2)：80.9 mmol/L醋酸鈉—甲醇—乙腈(體積比為1∶2∶2)；流動相流速1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；紫外檢測波長：330 nm，脯氨酸于263 nm處檢測。

(2) 游離Phe含量測定樣品處理：取一定量酶水解樣品，用10 g/100 g三氯乙酸等體積稀釋，靜置1 h，經(jīng)雙層濾紙過濾后取1 mL濾液于離心管內(nèi)，15 000 r/min離心20 min，取400 μL上清液于液相小瓶,待測。

(3) 氨基酸組成分析樣品處理：取1 mL樣品于水解管內(nèi)，依次添加12 mol/L HCl 1 mL和6 mol/L HCl 6 mL，充氮封管，置于120 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)水解22 h。水解完成后冷卻至室溫，添加10 mol/L NaOH 4.8 mL中和鹽酸，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶內(nèi)用去離子水定容，0.45 μm水系微濾膜過濾，取1 mL濾液于離心管內(nèi)，于15 000 r/min離心10 min，取400 μL 上清液于液相小瓶，待測。

1.2.2 Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe單因素試驗

配制4 g/100 g花生蛋白溶液，于90 ℃熱處理20 min。熱處理完成后冷卻至60 ℃，調(diào)節(jié)溶液pH至8.0，添加35 μL/g Alcalase2.4L水解110 min。水解完成后沸水浴滅酶10 min，冷卻至50 ℃，調(diào)節(jié)pH至7.0，添加5 000 U/g 木瓜蛋白酶水解3 h。水解完成后沸水浴滅酶，冷卻至室溫后6 000 r/min離心10 min，取上清液用于Flavourzyme再水解。

(1) 溫度對Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響：取等量水解液5份分別預(yù)熱至40，45，50，55，60 ℃，調(diào)節(jié)pH至7.0，均添加2 500 U/g Flavourzyme水解2.0 h。水解完成后沸水浴滅酶10 min，待冷卻至室溫后測定游離Phe含量。

(2) pH對Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響：取等量水解液5份預(yù)熱至50 ℃，調(diào)節(jié)pH至5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，添加2 500 U/g Flavourzyme水解2.0 h。水解完成后沸水浴滅酶10 min，待冷卻至室溫后測定游離Phe含量。

(3) 酶濃度對Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響：取等量水解液6份預(yù)熱至50 ℃，調(diào)節(jié)pH至6.5，分別添加1 500，2 000，2 500，3 000，3 500，4 000 U/g Flavourzyme水解2.0 h。水解完成后沸水浴滅酶10 min，待冷卻至室溫后測定游離Phe含量。

(4) 水解時間對Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響：取等量水解液6份，調(diào)節(jié)pH至6.5，均添加3 000 U/g Flavourzyme，分別水解1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 h。水解完成后沸水浴滅酶10 min，待冷卻至室溫后測定游離Phe含量。

1.2.3 Flavourzyme水解正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，固定水解時間為5 h，選擇溫度、pH及酶濃度為正交試驗因子，以水解所得游離Phe為指標(biāo)，設(shè)計三因素三水平正交試驗。

1.2.4 活性炭吸附分離Phe 活性炭是一種有極大比表面的多孔疏水性極性吸附劑，能夠特異性地吸附芳香族氨基酸。Phe在260 nm處有最強紫外吸收峰[17-18]，而非芳香族氨基酸在210～220 nm處有紫外吸收峰，因此，以吸附前后OD260的變化計算去除率，以O(shè)D220/OD260衡量活性炭吸附效果[19]。

(1) pH對吸附效果的影響：取水解液5份預(yù)熱至35 ℃，分別調(diào)節(jié)pH至2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，均添加5 g/100 g粉末活性炭，靜態(tài)吸附2.0 h。吸附完成后過濾，濾液稀釋10，20倍后分別測定OD260、OD220，計算去除率及OD220/OD260。

(2) 溫度對吸附效果的影響：取水解液5份分別預(yù)熱至25，30，35，40，45 ℃，均調(diào)整pH至3.5，添加5 g/100 g粉末活性炭，靜態(tài)吸附2.0 h。吸附完成后過濾，濾液稀釋10，20倍后分別測定OD260、OD220，計算去除率及OD220/OD260。

(3) 活性炭用量對吸附效果的影響：取水解液4份預(yù)熱至35 ℃，調(diào)整pH至3.5，分別添加3，5，7，9 g/100 g粉末活性炭，靜態(tài)吸附2.0 h。吸附完成后過濾，濾液稀釋10，20倍后分別測定OD260、OD220，計算去除率及OD220/OD260。

(4) 時間對吸附效果的影響：取水解液5份預(yù)熱至35 ℃，均調(diào)整pH至3.5，添加7 g/100 g粉末活性炭，分別靜態(tài)吸附0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h。吸附完成后過濾，濾液稀釋10，20倍后分別測定OD260、OD220，計算去除率及OD220/OD260。

1.2.5 活性炭吸附正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，固定吸附時間為2.5 h，選擇OD220/OD260為指標(biāo)，以溫度、pH及活性炭用量為正交試驗因子，設(shè)計三因素三水平正交試驗。

1.2.6 分子量分布分析

(1) 色譜條件：色譜柱：TSK gel 2000 SWXL (7.8 mm×300 mm)；紫外檢測器檢測波長：330 nm；流動相：乙腈—水—三氟乙酸(體積比為40∶60∶0.05)；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；混合標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C(MW12500)、桿菌酶(MW1450)、乙氨酸—酪氨酸—精氨酸(MW451)、乙氨酸—乙氨酸—乙氨酸(MW189)。

(2) 樣品處理：樣品經(jīng)0.45 μm水系微濾膜過濾。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 試驗重復(fù)3次，采用Origin 9.0及SPSS 20進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe

2.1.1 溫度對Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響 溫度對蛋白酶的水解反應(yīng)有兩方面的影響：① 通過影響分子熱運動而影響水解速率；② 影響蛋白酶的活性[20]202。由圖1可知，隨溫度的上升，分子熱運動加強，水解速率增快，游離Phe含量隨之上升。當(dāng)溫度升至50 ℃時，所得游離Phe含量達到了最高。當(dāng)溫度超過50 ℃后，游離Phe含量下降，可能是高溫致使蛋白酶變性導(dǎo)致活性下降。因此，F(xiàn)lavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的最適溫度在50 ℃左右。

2.1.2 pH對Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響 pH通過影響蛋白酶氨基酸側(cè)鏈基團的解離狀態(tài)，改變空間構(gòu)型，從而對酶的活性造成影響[20]202-203。由圖2可知，在選定的pH下，隨著pH的上升，水解活性增強，游離Phe含量也隨之上升。當(dāng)pH升至6.5時游離Phe含量達到了最高，繼續(xù)升高pH，其含量隨之下降，可能是過高的pH導(dǎo)致酶的空間構(gòu)型發(fā)生變化，活性下降。因此，F(xiàn)lavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的最適pH在6.5左右。

圖1 水解溫度對游離Phe含量的影響

圖2 水解pH對游離Phe含量的影響

2.1.3 酶濃度對Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響 蛋白酶催化水解反應(yīng)時，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r，酶濃度的上升能加速水解過程[20]205。由圖3可知，隨著酶濃度的上升，游離Phe含量隨之上升。當(dāng)濃度升至3 000 U/g時，游離Phe含量增幅減緩，因此選擇3 000 U/g為Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的最適酶濃度。

圖3 酶濃度對游離Phe的影響

圖4 水解時間對游離Phe含量的影響

2.1.4 水解時間對Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的影響 當(dāng)其他水解條件一定時，水解時間同產(chǎn)物成正比[20]209-210。由圖4可知，隨著水解時間的增加，游離Phe含量隨之上升，但水解5 h后所得游離Phe趨于穩(wěn)定。這是由于蛋白酶的水解作用具有位點特異性，隨著水解程度的加深，可供酶水解的位點逐漸減少，水解產(chǎn)物趨于平衡[21]。因此水解時間為5 h為宜，后續(xù)試驗固定水解時間為5 h。

2.2 Flavourzyme水解正交試驗

正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表1、2。

表1 水解正交試驗因素水平表

表2 水解正交試驗結(jié)果

由表2可知，影響Flavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的因素主次為RB>RA>RC，最佳水解工藝為50 ℃，酶濃度3 500 U/g，pH 6.5，水解5 h。經(jīng)次重復(fù)實驗驗證，在此工藝條件下水解所得游離Phe可達28.65 mg/100 mL。

2.3 活性炭分離Phe

2.3.1 溫度對吸附效果的影響 由圖5可知，溫度的上升有利于Phe的吸附。超過35 ℃時，Phe去除率下降，活性炭對其他氨基酸的吸附增加導(dǎo)致吸收示差下降。因此，活性炭吸附Phe的合適溫度在35 ℃左右。

2.3.2 pH對吸附效果的影響 pH一方面影響氨基酸在體系中的存在形式，另一方面通過影響活性炭分子表面的帶電情況而改變吸附能力[22-23]。由圖6可知，pH的上升有利于Phe的去除，pH超過3.0時，活性炭對Phe的吸附能力下降，對其他氨基酸的吸附能力增加導(dǎo)致吸收示差下降。因此，活性炭吸附去除Phe的最適pH在3.0左右。

圖5 吸附溫度對OD220/OD260及Phe吸附率的影響

Figure 5 Effect of adsorption temperature on the value ofOD220/OD260and the removal rate of Phe

圖6 吸附pH對OD220/OD260及Phe去除率的影響

圖7 活性炭添加量對OD220/OD260及Phe去除率的影響

Figure 7 Effect of the content of activated carbon on the value ofOD220/OD260and the removal rate of Phe

2.3.3 活性炭用量對吸附效果的影響 由圖7可知，隨著活性炭用量的增加Phe去除率及吸收示差均出現(xiàn)上升現(xiàn)象。當(dāng)添加量增至7 g/100 g時，Phe去除率趨于平緩，繼續(xù)增加用量對Phe去除率的貢獻有限，吸收示差的下降說明活性炭對其他氨基酸的吸附逐漸增強。因此，活性炭適宜添加量在7 g/100 g 左右。

2.3.4 吸附時間對吸附效果的影響 在活性炭吸附過程中，其不僅特異性地吸附Phe，對非芳香族氨基酸也有一定的吸附能力[22-23]。由圖8可知，吸附時間的延長有利于Phe的去除，但長時間的吸附會導(dǎo)致其他氨基酸大量損失，從而導(dǎo)致吸收示差大幅下降。因此，活性炭吸附Phe的時間應(yīng)在2.5 h 左右為宜，后續(xù)正交試驗固定水解時間為2.5 h。

圖8 吸附時間對OD220/OD260及Phe去除率的影響

2.4 活性炭吸附正交試驗

吸附正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3、4。

表3 吸附正交試驗因素水平表

表4 吸附正交試驗結(jié)果

由表4可知，影響活性炭吸附效果的主次因素為RB>RA>RC，最佳工藝為吸附溫度35 ℃，pH 3.0，活性炭用量7 g/100 g。經(jīng)3次平行實驗驗證，在此工藝條件下吸附2.5 h，OD220/OD260可達49.95，Phe去除率達到98.64%。

2.5 氨基酸組成分析

圖9 低苯丙氨酸肽混合物氨基酸圖譜

表5 低苯丙氨酸肽混合物氨基酸組成?

? “-”表示未檢測。

花生蛋白經(jīng)蛋白酶水解及活性炭吸附處理后，所得產(chǎn)物氨基酸組成見表5，氨基酸圖譜見圖9。由表5可知，經(jīng)活性炭吸附后Phe僅占17種總氨基酸含量的0.09%，符合GB 29922—2013中關(guān)于PKU患者專用特膳食品中Phe含量不得高于1.5 mg/g蛋白等同物的要求，因此，通過本工藝獲得的低苯丙氨酸肽混合物適合將來為PKU患者制備特膳食品。

2.6 分子量分布分析

花生蛋白雖然是一種具有較高營養(yǎng)價值的植物蛋白，但由于含有分子量在10～70 kDa的過敏性蛋白[24]，限制了其在食品行業(yè)的應(yīng)用。由圖10可知，經(jīng)蛋白酶水解及活性炭吸附，產(chǎn)物分子量主要為600 Da以下的低聚肽和游離氨基酸，過敏性蛋白被去除。人體對蛋白質(zhì)的吸收主要以低聚肽的形式為主[25]，因此，通過本工藝獲得的低苯丙氨酸肽混合物是一種不含過敏蛋白的可用于制備低苯丙氨酸特殊醫(yī)學(xué)配方食品的原料。

圖10 低苯丙氨酸肽混合物分子量分布圖譜

3 結(jié)論

通過試驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lavourzyme水解花生蛋白釋放游離Phe的最佳工藝條件為：溫度50 ℃，pH 6.5，酶添加量為3 500 U/g，水解5 h，在此工藝條件下游離Phe含量可達28.65 mg/100 mL。所得水解液添加7 g/100 g活性炭，于35 ℃，pH 3.0，吸附2.5 h，Phe去除率可達98.64%，OD220/OD260達到49.95。所得產(chǎn)物中Phe僅占總氨基酸的0.09%，且主要為600 Da以下的低聚肽及游離氨基酸，不含過敏性蛋白，完全滿足GB 29922—2013中，關(guān)于PKU患者特膳食品中Phe限量(≤0.15 mg/g蛋白質(zhì)等同物)的要求，適合將來為此類患者制備不同品類的特膳食品。

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