阿勒泰錦雞兒花及葉中總黃酮的超聲提取工藝、抗氧化活性及化學成分研究

古麗斯坦·阿不來提，迪里木拉提·毛里明，姚 軍

(新疆醫(yī)科大學藥學院， 烏魯木齊 830011)

錦雞兒，又名金雀花，屬豆科蝶形花亞科錦雞兒屬(CaraganachinensisiTurcz.exMaxim)植物[1-2]，全世界約有100余種，主要分布歐洲和亞洲的干旱和半干旱地區(qū)，我國產有62種，9個變種，12個變型[3]，其中阿勒泰錦雞兒產于我國新疆阿勒泰山青河地區(qū)[4]。研究表明錦雞兒中主要含有黃酮類、甾體類、萜類、生物堿類等化學成分[5-9]；黃酮類化合物是其主要成分[10]。黃酮類化合物具有降血壓、抗肝毒性、抗炎、抗菌、抗病毒、抗痙攣等藥理作用，其作用機理與總黃酮的抗氧化活性密切相關[11-14]。本研究采用超聲提取法提取阿勒泰錦雞兒葉和花中的總黃酮，通過響應面試驗優(yōu)化提取工藝，采用DPPH自由基、·OH自由基清除作用和銅離子還原能力試驗評價阿勒泰錦雞兒葉和花中總黃酮的抗氧化能力，采用LC-MS對阿勒泰錦雞兒葉和花中主要黃酮類成分進行化學成分分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器AB135-S型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，T6型新世紀型紫外-可見分光光度計(北京慧龍環(huán)科環(huán)境儀器有限公司)，HH-S4型恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)，LCQ DECA XP MAX型液相質譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher 公司)，X-calibur工作站。

1.2試藥蘆丁對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號20150721)，無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司，批號20160325)，二苯基苦基苯肼 (DPPH,上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號20161024)，新亞銅(上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號20161012)，醋酸銨(天津市盛奧化學試劑有限公司，批號20130412)，硫酸銅(天津市盛奧化學試劑有限公司，批號20141103)，抗壞血酸(天津歐博凱化工有限公司，批號20120812)，水楊酸(天津市天新精細化工有限公司，批號20120911)，氫氧化鈉(天津永晟精細化工有限公司，批號20150916)，硝酸鋁(天津市致遠化學試劑有限公司，批號2011-34)，亞硝酸鈉(天津市致遠化學試劑有限公司，批號20120106)，過氧化氫(天津市盛奧化學試劑有限公司，批號20111221)，試劑均為分析純。

1.3藥材阿勒泰錦雞兒全草2016年4月購于新疆阿勒泰地區(qū)哈薩克醫(yī)院藥房，經(jīng)新疆醫(yī)科大學藥學院帕麗達·阿不力孜教授鑒定為豆科錦雞兒屬植物阿勒泰錦雞兒(CaraganaaltaicaKom.Pojark)的全草。

1.4方法

1.4.1 對照品溶液的配制 稱取蘆丁對照品10 mg，用70%乙醇定容至50 mL容量瓶中，制得0.20 mg/mL的蘆丁對照品溶液，冷藏，備用。

1.4.2 標準曲線的繪制 量取蘆丁對照品溶液0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加入0.40 mL 5% NaNO2溶液，靜置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加入5.00 mL 4% NaOH溶液，用70%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻，靜置10 min，在510 nm處測定吸光度。以蘆丁對照溶液的濃度為橫坐標(C)，吸光度為縱坐標(A)繪制標準曲線，得回歸方程A=0.017 1C-0.003 3(R2=0.999 9)。

1.4.3 錦雞兒總黃酮的超聲提取方法 將阿勒泰錦雞兒花干燥后粉粹過40目篩，稱取1.00 g，加入70%乙醇溶液30 mL，浸泡15 min，在70℃下超聲40 min，抽濾，冷卻至室溫，取1 mL置于10 mL容量瓶中，按“1.4.2”項下方法測定吸光度，計算總黃酮含量。

1.4.4 單因素考察試驗 以阿勒泰錦雞兒花粉末為原料，設定超聲功率為300 W，乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1∶30，水浴溫度為60 ℃，超聲時間為40 min。固定其他條件，依次改變料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)、乙醇體積分數(shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、超聲時間(20、30、40、50、60 min)，以總黃酮提取含量為指標，采用單因素試驗篩選各因素水平，每組試驗重復3次。

1.4.5 Box-Behnken 響應面試驗優(yōu)化各因素水平 在單因素考察基礎上，確定Box-Behnken 響應面以總黃酮的提取含量為響應值，設計3因素3水平試驗方案，對提取工藝進行優(yōu)化，見表1。

表1 響應面試驗因素水平

1.4.6 阿勒泰錦雞兒葉和花中總黃酮抗氧化活性研究

1.4.6.1 DPPH自由基清除能力測定 稱取20 mg DPPH試劑，用無水乙醇溶解并定容于250 mL容量瓶，配制成濃度為2×10-4mol/L的溶液。取5支具塞試管依次加入(濃度為0.006、0.012、0.018、0.024、0.03 mg/mL)樣品溶液各2 mL及DPPH溶液2 mL，無水乙醇1 mL使反應總體積為5 mL，搖勻。遮光靜置30 min，于517 nm處測定吸光度(Ai)，計算清除率，以VC為陽性對照，每組試驗重復3次。式中：A0為無水乙醇2 mL+DPPH 2 mL+無水乙醇1 mL時的吸光度值；Aj為無水乙醇2 mL+待測樣品2 mL+無水乙醇1 mL時的吸光度值；Ai為待測樣品2 mL+DPPH 2 mL+無水乙醇1 mL時的吸光度值。

1.4.6.2 羥自由基清除能力測定 取5支具塞試管依次向其中加入2.0 mmol/L 的FeSO4溶液2.0 mL，1.0 mmol/L的 H2O22.0 mL，振蕩，搖勻，再加入6.0 mmol/L水楊酸3.0 mL，搖勻，于37℃水浴加熱15 min，在510 nm處測定吸光度(A0)，然后分別向5支試管中加入待測樣品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，再分別加入超純水0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL，搖勻，37℃下水浴加熱15 min，在510 nm處測定吸光度(Ax)，計算清除率。以VC為陽性對照，每組試驗重復3次。

1.4.6.3 銅離子還原能力的測定 分別取0.5 mL(濃度為0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 、4.8 mg/L)的樣品液，加入0.01 mol/L CuSO4和7.5 mmol/L新亞銅試劑各0.125 mL混合,再加入0.2 mol/L pH值為7.0的NH4Ac緩沖液至總體積為1.0 mL，搖勻，靜置30 min，于450 nm波長處測定吸光度，計算還原百分率。以VC為陽性對照，每組試驗重復3次。式中：A0為不加樣品時的吸光度值；Amax為在系列樣品溶液中溶液濃度最高時的吸光度值；A為樣品在450 nm處的吸光度值。

相對總還原百分率/%=(A-A0)/(Amax-A0)

1.4.7 花和葉中黃酮類成分質譜鑒定 色譜條件：Waters C18色譜柱(250 mm×3.0 mm，5 μm )；柱溫25℃；體積流速0.3 mL/min；進樣量5 μL；流動相為乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B)，梯度洗脫程序：0～25 min A：15%～50%。質譜條件：電噴霧離子源ESI，掃描范圍：100～1 100(m/z)，采用負離子檢出模式，干燥氣為N2，干燥氣溫度300℃，流速30 L/min，毛細管電壓30 V，霧化器壓力345 kPa，碰撞誘導解離電壓45 eV。

2 結果

2.1單因素試驗結果在超聲溫度為60～65℃條件下(1)控制反應條件：時間為40 min，乙醇體積分數(shù)為70%，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50時，超聲提取總黃酮的含量為10.30、13.81、14.74、15.43、15.55 mg/g，當料液比為1∶50時，總黃酮含量最高。(2)控制反應條件：時間為40 min，料液比為1∶50，乙醇體積分數(shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%時，超聲提取總黃酮的含量為16.63、17.42、17.81、19.36、19.41、18.84、16.0、11.72 mg/g，當乙醇濃度增加到60%時提取含量開始下降。(3)控制反應條件：料液比為1∶50，乙醇體積分數(shù)為60%，超聲時間分別為20、30、40、50、60 min時，超聲提取總黃酮的含量為21.12、21.63、22.72、22.85、20.31 mg/g，當超聲時間為50 min時總黃酮的含量最高。

2.2Box-Behnken響應面試驗分析以料液比(A)、提取時間(B)、乙醇體積分數(shù)(C)3個因素為自變量，總黃酮提取含量為響應值，通過三因素三水平響應面試驗，實驗結果見表2。通過軟件Design-Expert8.0.6 對表2的數(shù)據(jù)進行分析，得到方差分析結果，見表3和圖1-3。通過多元回歸擬合分析得到金雀花中總黃酮提取含量(Y)與料液比(A)、超聲時間(B)和乙醇體積分數(shù)(C)之間的二次多項回歸方程：Y=-0.032 313+(1.193×10-3)A+(1.617 5×10-4)B+(6.98×10-4)C+(1.25×10-6)AB-(7.5×10-7)AC+(2.5×10-6)BC-(1.36×10-5)A2-(2.35×10-6)B2-(6.35×10-6)C2。根據(jù)方差分析結果，回歸方程的P=0.005 8<0.01，表明試驗所用的模型極為顯著，可進行響應值預測，失擬項檢驗的P=0.169 5，R2=0.912 5，模型對實際情況擬合良好。二次模型統(tǒng)計學分析表明，各因素對總黃酮提取含量的影響大小順序為B>C>A。通過軟件Design-Expert8.0.6 得出最佳提取工藝條件：乙醇體積分數(shù)(C)為60%、料液比(A)1∶47.40、超聲時間(B)50 min；為操作可行，將料液比調整為1∶50。根據(jù)所得的條件進行3組驗證實驗，總黃酮平均提取含量為22.3 mg/g，測定結果穩(wěn)定，偏差不大，證明該結果合理可靠。

表2 box-behnken試驗設計及結果

2.3阿勒泰錦雞兒花、葉、根、莖中總黃酮提取含量的測定在最佳提取工藝條件下測得阿勒泰錦雞兒不同部位中總黃酮的含量分別為：花22.3 mg/g，葉27.3 mg/g，根8.71 mg/g ，莖6.55 mg/g。

2.4抗氧化試驗錦雞兒葉和花中總黃酮對DPPH自由基、·OH自由基的清除能力和銅離子還原能力隨著黃酮濃度的增大而增加。當總黃酮濃度為0.04 mg/mL時葉和花對DPPH自由基清除率分別為79.7%、84.4%，相同濃度的陽性對照VC的清除率為90.3%；當總黃酮濃度為3.2 μg/mL時葉和花對銅離子總還原百分率分別為85.4%、91.8%，相同濃度的陽性對照VC的清除率為96.3%；表明，隨著溶液濃度的升高，葉和花中總黃酮的DPPH自由基清除率和銅離子還原百分率逐漸緩慢接近于VC的清除率；當總黃酮濃度為4.0 mg/L時葉和花對·OH自由基清除率分別為27.1%、30.5%，相同濃度的陽性對照VC清除率為71.2%、由此可知花和葉的·OH自由基的清除能力遠小于VC的清除率，見圖4-6。

表3 多項式模型方差分析

注：顯著性，**P<0.01顯著，*P<0.05較顯著。

圖1 料液比與提取時間響應面圖

圖2 料液比與乙醇體積分數(shù)響應面圖

圖3 提取時間與乙醇體積分數(shù)響應面圖

2.5花和葉中黃酮類成分質譜鑒定通過最佳提取工藝提取葉和花中總黃酮，利用質譜鑒定得到花和葉的總離子流圖，見圖7-8。通過LC-MS鑒定花和葉樣品中黃酮類成分，錦雞兒花中有9種黃酮苷，葉中有8種黃酮苷，其花和葉中共有的為：槲皮素-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖-7-O-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖苷、蘆丁、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷。異鼠李素-3-O-葡萄糖苷只存在于葉中，而楊梅素-3-O-蕓香糖苷和異鼠李素-3-O-鼠李糖(1→2)鼠李糖(1→6)葡萄糖苷存在于花中。花中山奈酚-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖-7-O-鼠李糖苷和蘆丁的含量較高，葉中山奈酚-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖苷和蘆丁的含量較高，見表4。

圖4VC與葉、花中總黃酮的DPPH自由基清除能力

圖5VC與葉、花中總黃酮的銅離子還原能力

圖6VC與葉、花中總黃酮的·OH自由基清除能力

圖7錦雞兒花的總離子流圖

圖8錦雞兒葉的總離子流圖

表4 阿勒泰錦雞兒花與葉主要黃酮苷的質譜數(shù)據(jù)和鑒定結果

3 討論

楊申明等[15]采用回流提取法提取錦雞兒花，結果花中總黃酮含量為1.543mg/g，而本研究采用超聲提取法提取錦雞兒花和葉，結果花中總黃酮含量為22.3mg/g，葉中總黃酮含量為27.3mg/g。由于

加熱回流等傳統(tǒng)提取方法費時、操作繁瑣，藥材長期處于高溫狀態(tài)易發(fā)生氧化，超聲提取所需時間短，避免了藥材長時間處于高溫下的氧化，從而使得產率和產品質量都得以提高[16]。本研究采用3種抗氧化試驗評價阿勒泰錦雞兒葉和花中總黃酮的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)阿勒泰錦雞兒花中總黃酮含量低于葉中的總黃酮含量，但其抗氧化能力強于葉。采用LC-MS對阿勒泰錦雞兒葉和花進行化學成分分析，發(fā)現(xiàn)阿勒泰錦雞兒葉和花中所含黃酮苷的種類相似，但花和葉中各種黃酮苷含量不同，由于不同種黃酮的抗氧化能力不同，因此盡管花中總黃酮含量低于葉，但其抗氧化能力強于葉。

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