遠程缺血預(yù)處理和遠程缺血后處理在兔肺移植缺血-再灌注損傷保護作用中的比較

姜 濤， 魏 琴， 劉媛媛， 馬 嵋， 張 春， 伊力亞爾·夏合丁， 朱 輝

(1新疆醫(yī)學(xué)動物模型研究重點實驗室， 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2臨床醫(yī)學(xué)研究院, 3次消毒供應(yīng)室,4教學(xué)科, 5胸外科， 烏魯木齊 830054)

肺移植是治療晚期惡性肺部疾病如慢阻肺、肺纖維化、支氣管擴張癥等的最終選擇[1]，而肺移植中最普遍的問題就是缺血-再灌注損傷(IRI)，如時間過長，就會引起全身器官不同程度的損傷，甚至發(fā)生不可逆性的損害[2]。前期研究已經(jīng)將缺血預(yù)處理和缺血后處理對缺血再灌注損傷的作用進行了比較研究，取得較好結(jié)果。但是缺血預(yù)處理或者后處理可能會對局部組織器官造成損傷，在一定程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用。如果能在不影響局部組織器官血供的情況下同樣起到保護作用，將對臨床應(yīng)用有更大意義。故本研究選擇了遠程缺血預(yù)處理(RIPC)和遠程缺血后處理(RIPOST)比較研究對IRI的作用。RIPC是指通過對一個遠端組織或器官行短暫的非致死性的缺血再灌注后可加強其遠隔組織或臟器對較長時間缺血的耐受性。已有研究證實，遠程缺血預(yù)處理對心、肝、腦、肺等臟器的缺血再灌注損傷有保護作用[3-6]。Kerendi等[7]提出了RIPOST的概念，即再灌注開始后，通過對遠離靶器官的非重要組織或器官進行處理以保護某些對缺血敏感的靶器官，已有研究證實RIPOST能提高心肌、肺臟及肝臟等臟器對較長時間缺血的耐受性[8-10]。故本課題選擇肺移植模型，檢測干預(yù)前后的氧分壓(PaO2)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF-α)含量和肺濕/干重比(W/D)，比較RIPC和RIPOST在缺血再灌注損傷中的保護作用，以探討其在不影響局部組織器官血供的情況下是否可以同樣起到保護作用。

1 材料與方法

1.1動物實驗新西蘭大白兔48只，2月齡，雄性，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。動物模型的建立在新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院動物部進行，該部門具有國際AAALAC資質(zhì)認證，實驗動物的管理與使用遵循“Guide for care and use of Laboratory animals”，動物實驗經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院IACUC的審批，倫理審批號: IACUC-20160709013。

1.2實驗設(shè)計與分組48只新西蘭大白兔用隨機數(shù)字表隨機均分為3組，每組16只(n=16)，每組按體質(zhì)量相近原則配對，分為缺血再灌注組(IR組)、遠程缺血預(yù)處理組(RIPC組)、遠程缺血后處理組(RIPOST組)。

1.3肺移植動物模型制備參照文獻[11]中的肺移植模型制備方案。

1.4不同干預(yù)組的實施方案

1.4.1 IR組 僅實施異體肺移植。

1.4.2 RIPC組 供體實施。動物麻醉后氣管插管接呼吸機，左側(cè)第五肋間開胸后解剖分離上、下腔靜脈和左肺動脈、靜脈及左主支氣管。阻斷上、下腔靜脈回心血流，用4℃的乳酸林格氏液以20 cm水柱壓力依次經(jīng)右心室和左心房進行順行灌注和逆行灌注(150 mL/kg)。半膨脹狀態(tài)切取左肺保存?zhèn)溆谩Ｔ诠w肺灌注之前，以血管夾反復(fù)阻斷右側(cè)股動脈血流3次，每次阻斷時間為5 min，間隔時間為5 min。

1.4.3 RIPOST組 受體實施。麻醉及開胸同上，解剖游離支氣管及血管，阻斷左肺動脈及支氣管，鉗夾肺靜脈匯合處的左心房側(cè)壁。切斷支氣管、血管及心房壁，切除左肺。供肺包裹后置入受體左胸腔。依次吻合支氣管、左心房壁和肺動脈，開放肺靜脈，開放肺動脈，吻合口無出血漏氣，肺血流通暢，動物生命體征平穩(wěn)。受體肺移植操作完成后，移植肺開始恢復(fù)血流灌注前，先反復(fù)開放和阻斷受體由下肢股動脈血流5次，每次阻斷與間隔時間為1 min。

1.5標(biāo)本采集所有模型動物于受體肺切除前、再灌注后60、120 min3個時間點經(jīng)左肺下靜脈采血測PaO2。再灌注完后采血用于檢測SOD、MDA、NO和TNF-α。取肺組織約0.5 g稱濕重，真空干燥箱100℃烘干烤24 h，稱干重，計算肺濕/干重比。取肺組織指甲蓋大小置于10%甲醛液固定，用于病理學(xué)檢測。

1.6病理檢測肺組織固定于10%甲醛，石蠟包埋，脫水，切片機(Leica ,德國)切片厚3 μm，進行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.7SOD、MDA、NO和TNF-α檢測SOD和MDA是反映自由基損傷的指標(biāo)。通過測定SOD含量間接反應(yīng)肺組織清除超氧自由基和抗氧化損傷的能力，按照說明書操作測試(ADL 公司,USA)。而MDA作為脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，測定其含量可間接反應(yīng)細胞損傷的程度，按照說明書操作測試(ADL 公司,USA)。NO能夠參與體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等多個環(huán)節(jié)，可以通過調(diào)節(jié)血管張力、抑制血小板聚集、抑制白細胞的黏附而發(fā)揮對缺血再灌注的保護作用，按照說明書操作測試(ADL公司,USA)。TNF-α按照說明書操作測試(ADL公司,USA)。所有檢測使用Thermo Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀測試。

2 結(jié)果

2.1動物造模情況本研究選用新西蘭兔48只，供受體均為24只，供體無死亡，受體手術(shù)死亡5只，模型成功19只。左肺移植受體成模情況見表1。

2.2肺組織病理改變?yōu)榱擞^察不同保護措施在缺血再灌注損傷發(fā)生時的作用，采用HE染色觀察肺組織的病理改變。IR組：低倍鏡下可見肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分肺泡壁斷裂，肺泡腔大小不等，肺泡內(nèi)可見大量出血、水腫、部分不張(圖1a)；RIPC組:低倍鏡下可見肺泡腔大小不等，結(jié)構(gòu)紊亂，肺不張、肺氣腫及水腫明顯，可見大量炎癥細胞浸潤(圖1b)；RIPOST組: 低倍鏡下滿視野肺水腫及大量炎癥細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)不完整，部分肺泡壁斷裂(圖1c)。

表1 左肺移植受體成模情況

a: IR組

b： RIPC組

c： RIPOST組

圖1肺組織病理改變(HE,×100)

2.3各組PaO2在不同時間的變化不同時間點各組PaO2含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在60、120 min時，RIPC組PaO2高于IR組、RIPOST組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而IR組與RIPOST組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

2.4不同干預(yù)組SOD、MDA、NO、TNF-α及肺濕/干重比的變化3組MDA、SOD、NO、TNF-α差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與IR組比較，RIPC組SOD、NO高于IR組及RIPOST組，而MDA、TNF-α低于IR及RIPOST組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而IR組與RIPOST組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表2 各組在不同時間的PaO2比較

注：與IR組比較，*P<0.05；與RIPC組比較，△P<0.01。

表3 遠程缺血預(yù)處理、遠程缺血后處理對缺血再灌注的保護作用比較

注：與IR組比較，*P<0.05；與RIPC組比較，△P<0.05。

3 討論

肺移植是治療晚期惡性肺部疾病如慢阻肺、肺纖維化、支氣管擴張癥等的最終選擇，缺血再灌注損傷是肺移植失敗的主要原因之一，而在缺血再灌注發(fā)生過程中產(chǎn)生的大量氧自由基和細胞內(nèi)鈣超載，是導(dǎo)致肺損傷的主要原因。本研究選用RIPC和RIPOST的干預(yù)方案探討對IRI的保護作用的方法,通過監(jiān)測移植再灌注后60、120 min PaO2的變化，觀察肺組織病理改變，檢測血清中SOD、MDA、NO、TNF-α和肺W/D來評價何種方式更有利于保護肺損傷。

本實驗通過制作新西蘭兔肺移植模型，在缺血再灌注損傷時給予遠程缺血預(yù)處理和遠程缺血后處理的不同干預(yù)方法。從我們的實驗結(jié)果可以看出，IR組的病理呈現(xiàn)出明顯的肺損傷；RIPC組可見肺泡腔大小不等，結(jié)構(gòu)紊亂，肺不張、肺氣腫及水腫明顯，和IR組比較損傷明顯減輕；RIPOST組肺泡組織塌陷嚴(yán)重，損傷也是較為嚴(yán)重。這符合Pankaj等[12]研究的RIPC對組織和臟器缺血再灌注損傷有保護作用。有研究表明，肺缺血再灌注損傷中肺氣體交換功能可作為重要的評價指標(biāo)[13]，肺換氣功能障礙時PaO2明顯下降。在本實驗中，IR組和RIPOST組在120 min PaO2明顯下降，經(jīng)比較RIPC組與前兩組存在差異，可能提示RIPC組有助于提高氧分壓。結(jié)合病理結(jié)果可以看出RIPC減輕了肺毛細血管和肺泡損傷，可能改善了肺的氣體交換功能，從而對肺IRI起到了保護作用。

缺血再灌注時，活性氧產(chǎn)生過多引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)可生成MDA，因而測定MDA可代表脂質(zhì)過氧化的程度。SOD能特異性清除超氧自由基，增強機體的抗氧化能力，可促進再灌注損傷臟器的恢復(fù)[14]。本實驗中發(fā)現(xiàn)RIPC組的MDA活性明顯低于IR組和RIPOST組，而SOD的含量明顯高于IR組和RIPOST組。提示RIPC組肺部的脂質(zhì)過氧化程度減弱，抗氧化能力增強，說明單側(cè)下肢遠程缺血預(yù)處理對肺缺血再灌注引起的肺損傷有良好的保護作用。NO具有舒張血管和局部抗炎的功能。有研究結(jié)果顯示，吸入低濃度NO預(yù)處理對肺IRI具有保護作用[15]。本實驗中RIPC組的NO活性明顯高于IR組和RIPOST組，提示可能RIPC上調(diào)NO表達來對抗氧自由基的形成和中性粒細胞聚集,以達到保護肺損傷的效果。TNF-α是參與炎性損傷過程的重要促炎因子[16]，可通過刺激粒細胞釋放炎性介質(zhì)和蛋白酶，并產(chǎn)生級聯(lián)放大作用，從而直接損傷內(nèi)皮細胞，使毛細血管通透性增加，加重缺血再灌注損傷[17]。本研究顯示，RIPC組的TNF-α活性明顯低于IR組和RIPOST組，提示RIPC可以抑制肺IRI的炎癥反應(yīng)。

總之，本研究探討在新西蘭大白兔肺移植的缺血再灌注損傷過程中，采用了遠程缺血預(yù)處理和后處理的方式，經(jīng)比較認為遠程缺血預(yù)處理方案對再灌注損傷保護作用較好。本實驗作為基礎(chǔ)研究，對于臨床問題缺血再灌注損傷提供了損傷小、保護效果好的實驗方案——遠程缺血預(yù)處理，對臨床應(yīng)用有一定意義。但是疾病的發(fā)生發(fā)展并不是獨立存在的，全身的器官、組織、細胞乃至免疫系統(tǒng)都在發(fā)生級聯(lián)發(fā)應(yīng)，本研究只是做了部分基礎(chǔ)研究，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，下一步將進行具體的機制研究。

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