黃芪多糖對結腸炎小鼠結腸黏膜JAK/STAT信號的調控作用

趙海梅, 鹿秀云, 岳海洋, 劉 億, 劉雪珂, 黃小英, 劉端勇

(江西中醫(yī)藥大學1. 基礎醫(yī)學院、2. 科技學院、3. 研究生院、4. 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004)

Janus活化激酶 (Janus activated kinase, JAK)/信號轉導與轉錄激活子(signal transducer and activator of transcriptions, STAT) 途徑介導了炎癥性腸病的發(fā)生和發(fā)展[1]。黃芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS) 是黃芪的主要活性成分之一，可有效治療實驗性結腸炎[2]，但其作用機制是否與調節(jié)結腸黏膜JAK/STAT信號表達有關尚不清楚。

1 材料

1.1動物及分組清潔級健康 C57BL/6小鼠40只，♂，體質量(20 ± 2) g ，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。隨機分為 4組，即正常組(Normal)、模型組(TNBS)、黃芪多糖組(TNBS+APS)、美沙拉嗪組(TNBS+Mes)，每組10只，適應性飼養(yǎng)3 d。

1.2藥物與試劑APS購自陜西森弗生物技術有限公司；美沙拉嗪購自佳木斯鹿靈制藥有限公司；三硝基苯磺酸 (2, 4, 6 -trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS) 購自Sigma公司；JAK2、p-JAK2、STAT6、p-STAT6、SOCS1、SOCS3抗體均購于Abcam公司。

1.3儀器低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；電泳儀(Bio-Rad公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(力新儀器)；漩渦混勻器 (德國 IKA公司)。

2 方法

2.1動物模型的制備與給藥[3]造模前禁食12 h，除正常組外，小鼠麻醉后，按100 mg·kg-1TNBS計算，將其溶入0.15 mL 50%乙醇配制TNBS乙醇復合溶液，并注入距肛門約4 cm 處，倒置小鼠5 min，放回原籠中自然蘇醒。造模24 h后，按體質量換算，黃芪多糖200 mg·kg-1灌胃，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪150 mg·kg-1灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。

2.2動物處理與病理學觀察d 8，分離結腸，測量長度，觀察腸黏膜損傷程度，稱量。準備病理切片，光學顯微鏡觀察并評分。

2.3Westernblot檢測相關蛋白分子表達制備結腸組織勻漿，測蛋白含量。電泳后電轉PVDF膜上，加JAK2、p-JAK2、STAT6、p-STAT6、SOCS1、SOCS3、GAPDH一抗，4℃孵育過夜，二抗孵育1 h后，曝光顯影，進行條帶灰度值的分析。

3 結果

3.1結腸長度、重量及病理損傷程度評測如Tab 1所示，與模型組相比較，APS組結腸長度無明顯縮短(P<0.01)，腸重、結腸重量指數(shù)及病理損傷評分明顯下降(P<0.05或P<0.01)。同時病理形態(tài)學觀察可見，經(jīng)APS和美沙拉嗪治療后，結腸黏膜相對完整，少量炎細胞浸潤，無明顯潰瘍形成。

Tab 1 Therapeutic effect of APS treated colitis mice

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsTNBS model

3.2APS能調控結腸炎小鼠結腸黏膜JAK/STAT信號表達與模型組相比較，APS給藥后，結腸黏膜p-JAK2和p-STAT6表達明顯下降，且p-JAK2/JAK2和p-STAT6/STAT6比值也明顯下降(P<0.05或P<0.01)，而SOCS1和SOCS3的表達明顯升高(P<0.05或P<0.01)。

4 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，APS可明顯降低結腸炎小鼠結腸質量指數(shù)，恢復結腸長度，緩解結腸黏膜病理性損傷，提示APS可有效治療TNBS誘導的小鼠結腸炎。同時發(fā)現(xiàn)經(jīng)APS治療后，結腸炎小鼠結腸黏膜JAK2和STAT6蛋白磷酸化表達明顯下降，而SOCS1和SOCS3的表達明顯升高，提示APS有效治療小鼠結腸炎可能是通過抑制JAK/STAT信號活化實現(xiàn)的。

JAK/STAT途徑廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、免疫調節(jié)等過程[1]，其負性調控與SOCS正相關，該信號可通過樹突狀細胞調控Th1/Th2和Th17/Treg型細胞因子間平衡。如樹突狀細胞可通過JAK/STAT高度表達IL-12而誘導Th1型細胞產(chǎn)生；JAK/STAT被抑制，則IL-12、IFN-γ和 IL-23產(chǎn)生減少，誘導Th2細胞增加[4]?；駾Cs激活STAT3，增加IL-10和TGF-β表達，最終誘導Treg增殖[5]。Th1/Th2和Th17/Treg型細胞因子間平衡及其細胞因子在潰瘍性結腸炎的發(fā)病過程中扮演重要角色。我們前期研究基礎發(fā)現(xiàn)，APS有效治療實驗性結腸炎的同時，腸黏膜組織Treg細胞水平升高，且IL-2、IL-6、IL-17、IL-23下調，TGF-β1 和 STAT5a水平升高，提示APS有效治療UC可能是通過調節(jié)Treg/Th17間平衡來實現(xiàn)[6]。結合本實驗，APS給藥治療后，小鼠結腸黏膜中JAK/STAT信號活化明顯抑制，而SOCS1和SOCS3的表達明顯升高，說明APS可能通過抑制JAK/STAT信號活化達到治療目的。我們預測其可能和APS通過該途徑調控樹突狀細胞成熟和活化有關，需要進一步研究，此將有助于全面揭示APS調節(jié)免疫治療結腸炎的作用機制。

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