活血軟堅(jiān)方在斑馬魚和內(nèi)皮細(xì)胞模型上的促血管新生作用及其機(jī)制研究

朱思行，曲 暢，朱靈妍，趙外榮，馬子霖，周忠焱，唐靖一

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200032；2. 大連市婦女兒童醫(yī)療中心，遼寧 大連 116037；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院心病研究室，上海 200032)

冠心病心肌缺血側(cè)枝循環(huán)代償建立不足的重要病理生理基礎(chǔ)是其血管新生不足。促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)的建立，以自我搭橋的方式緩解缺血區(qū)血管的病理癥狀成了尋求冠心病等缺血性疾病治療方法的另一有效手段和理想途徑。所以，開展促血管新生作用的研究和其作用機(jī)制的探索，對(duì)血管新生不足導(dǎo)致的冠心病的防治有著重要現(xiàn)實(shí)意義。中醫(yī)中藥在促血管新生方面具有其獨(dú)特且長(zhǎng)足的優(yōu)勢(shì)[1]，借助以轉(zhuǎn)基因斑馬魚快速篩選、高通量化、與人的遺傳物質(zhì)相似度高等優(yōu)點(diǎn)來(lái)作為藥物篩選模型已成為研究的熱點(diǎn)[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是重要的血管新生因子，參與調(diào)控人體內(nèi)血管的正常發(fā)育，故VEGF及其受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)的表達(dá)是影響血管新生相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)鍵[3]，也是中藥促血管新生的重要作用機(jī)制。活血軟堅(jiān)方(SEHM)是全國(guó)名中醫(yī)嚴(yán)世蕓教授治療胸痹心痛的常用基礎(chǔ)方。處方由三棱、莪術(shù)、海藻、牡蠣四味藥組成，藥味精少，卻包含活血和軟堅(jiān)兩法，故在臨床上行之有效。

本研究通過(guò)在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，研究活血軟堅(jiān)方對(duì)冠心病的治療，并且驗(yàn)證其具有促進(jìn)血管新生的作用及作用機(jī)制，為中醫(yī)藥促血管新生的研究提供現(xiàn)代生物學(xué)依據(jù)，旨在揭示活血軟堅(jiān)方促血管新生的內(nèi)在規(guī)律，為該方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為后續(xù)具有基因調(diào)控作用的促血管新生創(chuàng)新藥物研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1動(dòng)物與細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記綠色熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(fli-1a:EGFP)y1斑馬魚，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院斑馬魚實(shí)驗(yàn)室提供。人臍靜脈融合內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購(gòu)自ATCC。

1.2藥物與試劑活血軟堅(jiān)方水煎液的配制：活血軟堅(jiān)方(三棱12 g、莪術(shù)12 g、海藻30 g、生牡蠣30 g)中藥統(tǒng)一采用傳統(tǒng)方法水煎并水浴濃縮至1 kg·L-1，由上海龍華醫(yī)院制劑室制備，所用中藥購(gòu)自龍華醫(yī)院中藥房，經(jīng)鑒定，產(chǎn)地明確，各中藥含量以藥物指紋圖譜進(jìn)行控制。臨用前均用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，得到澄清液體，分裝后冷藏于-20℃冰箱儲(chǔ)存。內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VRI)，購(gòu)自Calbiochem公司，溶解于DMSO中，并配制為100 mmol·L-1，-20℃儲(chǔ)存。Tripure Reagent購(gòu)自Roche公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)和ROX購(gòu)自TaKaRa公司；DEPC水購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗VEGFR-1(AF0315)抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；兔抗Akt(4685S)、p38(8690S)、p-p38(9215S)、p44/42(4695S)、p-p44/42(4370S)抗體，均購(gòu)自CST公司。

1.3儀器Nikon熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；熒光定量PCR儀(Funglyn Biotech公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；28.5℃培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraues公司)。

2 方法

2.1斑馬魚體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)選擇狀態(tài)良好，受精24 h的斑馬魚幼魚放入每孔含1 mL飼養(yǎng)液的24孔板中，每孔8條。采用3倍濃度梯度稀釋法，用胚胎培養(yǎng)液稀釋活血軟堅(jiān)方水煎液至300、100、30、10、3、1 g·L-1，以培養(yǎng)液為空白對(duì)照組。加完藥物放入28.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察斑馬魚的狀態(tài)。

2.2促斑馬魚腸下靜脈新生實(shí)驗(yàn)選擇狀態(tài)良好，受精24 h的斑馬魚幼魚，使用鑷子除去胚胎軟殼，將其放入含有1 mL飼養(yǎng)液的24孔板中，(每孔8個(gè))。采用3倍濃度梯度稀釋法，用胚胎培養(yǎng)液稀釋活血軟堅(jiān)方水煎液到安全劑量及以下為加藥組，以培養(yǎng)液為空白對(duì)照組。加完藥物放入28.5℃的飼養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，清洗24孔板上的加藥孔，重新加入培養(yǎng)液和不同濃度的活血軟堅(jiān)方水煎液，操作同d 1。培養(yǎng)48h后在熒光倒置，顯微鏡下觀察活血軟堅(jiān)方在不同濃度下對(duì)斑馬魚腸下靜脈血管(SIVs)的影響。干預(yù)時(shí)間為48 h。斑馬魚腸下血管出芽數(shù)統(tǒng)計(jì)方法=血管出芽數(shù)×1。斑馬魚腸下血管交叉數(shù)(Crossing points)統(tǒng)計(jì)方法=血管交叉數(shù)×1。

2.3VRI誘導(dǎo)斑馬魚節(jié)間血管損傷實(shí)驗(yàn)選擇發(fā)育24 h、狀態(tài)良好的斑馬魚幼魚，放入含有每孔1 mL培養(yǎng)液的24孔板中，每孔8條。采用濃度梯度稀釋法，使培養(yǎng)液中各組的VRI濃度依次為120、100、80、60、40 nmol·L-1，并以培養(yǎng)液為空白對(duì)照組，以確定VRI對(duì)斑馬魚節(jié)間血管(ISVs)的影響及VRI模型的最佳濃度。放入28.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并至24 h時(shí)熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。斑馬魚節(jié)間血管數(shù)統(tǒng)計(jì)方法=完整血管數(shù)×1+不完整血管數(shù)×0.5。

2.4斑馬魚節(jié)間血管損傷的保護(hù)實(shí)驗(yàn)選擇狀態(tài)良好、受精24 h的斑馬魚幼魚，將其放入加有培養(yǎng)液的24孔板中，每孔8條。以VRI 100 nmol·L-1濃度為培養(yǎng)液，采用3倍濃度梯度稀釋法，加入不同濃度的活血軟堅(jiān)方水煎液為加藥組，并設(shè)不加入VRI的培養(yǎng)液為空白對(duì)照組，放入28.5℃的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)至約受精48 h，即干預(yù)時(shí)間為24 h。斑馬魚節(jié)間血管數(shù)統(tǒng)計(jì)方法同“2.3”。

2.5Real-timePCR檢測(cè)斑馬魚體內(nèi)VEGFRmRNA選擇受精24 h的斑馬魚幼魚于24孔板中，每孔10條。分為空白對(duì)照組、模型組( VRI 100 nmol·L-1) 、活血軟堅(jiān)方不同劑量組( VRI + SEHM 10、30、100 g·L-1)，藥物干預(yù)24 h后，用Tripure提取各組斑馬魚總RNA，使用轉(zhuǎn)錄因子cDNA合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取反轉(zhuǎn)錄后cDNA作為模板，使用SYBR Green Master進(jìn)行定量PCR。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性20 s；60℃退火30 s，72℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)flt1、kdr、kdrl基因的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見Tab 1。

2.6HUVEC細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)將HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞懸液按每孔100 μL，終濃度為1×107·L-1加入96孔板中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，抽去舊培養(yǎng)液；將活血軟堅(jiān)方水煎液用0.5%的DMEM培養(yǎng)液稀釋成300、100、30、10 g·L-1，再以每孔100 μL的量加入96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。另設(shè)6個(gè)只加0.5%的DMEM培養(yǎng)液的復(fù)孔作為空白對(duì)照組。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的1%的MTT，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后吸棄MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO后放置搖床上避光震蕩15min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度值(OD值)。

Tab 1 Gene and primer for real-time PCR

2.7HUVEC細(xì)胞促增殖實(shí)驗(yàn)根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，選擇活血軟堅(jiān)方安全濃度進(jìn)行促細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。步驟中除了將細(xì)胞懸液終濃度調(diào)整為3×107·L-1進(jìn)行加藥孵育外，其余皆同“2.6”。

2.8Westernblot檢測(cè)HUVEC細(xì)胞血管新生相關(guān)蛋白的表達(dá)根據(jù)每個(gè)培養(yǎng)皿中細(xì)胞數(shù)量加入含相應(yīng)比例的RIPA，待充分裂解后提取蛋白，10 000×g、4℃離心5 min后取上清，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取20 μg總蛋白進(jìn)行凝膠電泳，后采用電壓為120 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min的半干轉(zhuǎn)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的PBST封閉2 h后，孵以1 ∶1 000稀釋的一抗，4 ℃過(guò)夜。洗膜后加入以1 ∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h后，將膜放入發(fā)光成像儀中，滴加發(fā)光試劑曝光。檢測(cè)Akt、p38、p-p38、p44/42、p-p44/42、VEGFR-1表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參。

3 結(jié)果

3.1活血軟堅(jiān)方對(duì)斑馬魚的毒性作用活血軟堅(jiān)方水煎液300 g·L-1組的斑馬魚全部死亡，100、30、10、3、1 g·L-1組斑馬魚存活率分別為89.58%、87.5%、87.5%、89.58%、87.5%(Tab 2)。故活血軟堅(jiān)方水煎液的安全劑量為100 g·L-1及以下。

3.2活血軟堅(jiān)方對(duì)斑馬魚腸下靜脈促生長(zhǎng)作用如Fig 1、Tab 3所示，活血軟堅(jiān)方水煎液在1、10、30、100 g·L-1濃度下對(duì)斑馬魚腸下靜脈有明顯出芽且交叉數(shù)量有明顯增多(P<0.05或P<0.01)。

Tab 2 Toxicity of SEHM in zebrafish

Tab 3 Effect of SEHM in zebrafish SIVs and crossing points[M(QL～QU)]

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.3VRI誘導(dǎo)斑馬魚節(jié)間血管的損傷

如Fig 2、Tab 4所示，與空白對(duì)照組比較，在40～120 nmol·L-1的濃度下，VRI對(duì)斑馬魚節(jié)間血管均有不同程度的損傷，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在考慮到對(duì)血管損傷程度較大，有利于藥物作用的觀察，但又不至于損傷程度過(guò)重而難以恢復(fù)，最終選取100 nmol·L-1作為VRI斑馬魚節(jié)間血管損傷模型的造模濃度。

Tab 4 Damage of VRI-induced ISVs[M(QL～QU)]

**P<0.01vscontrol

Fig 1 Effect of SEHM in zebrafish SIVsA：Control; B～F: SEHM 1, 3, 10, 30, 100 g·L-1

Fig 2 Damage of VRI-induced ISVs

A：Control; B～F: VRI 40, 60, 80, 100, 120 nmol·L-1

3.4活血軟堅(jiān)方對(duì)斑馬魚節(jié)間血管損傷的保護(hù)作用如Fig 3、Tab 5所示，與對(duì)照組比較，VRI組的斑馬魚節(jié)間血管數(shù)明顯減少，說(shuō)明VRI對(duì)斑馬魚節(jié)間血管有明顯損傷(P<0.01)，表明轉(zhuǎn)基因斑馬魚節(jié)間損傷模型造模成功；和VRI組比較，活血軟堅(jiān)方水煎液在3、10、30、100 g·L-1濃度下對(duì)斑馬魚節(jié)間血管均有明顯恢復(fù)和保護(hù)作用(P<0.01)。

Fig 3 Effect of SEHM in VRI-induced zebrafish ISVs

A：Control; B：VRI 100 nmol·L-1; C～F：VRI+SEHM 3, 10, 30, 100 g·L-1

Tab 5 Effect of SEHM in zebrafish ISVs[M(QL～QU)]

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsVRI

3.5活血軟堅(jiān)方對(duì)斑馬魚體內(nèi)VEGFRmRNA表達(dá)的影響如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，VRI組flt-1、kdr、kdrl的mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，VRI+10 g·L-1活血軟堅(jiān)方組flt-1 mRNA表達(dá)量與VRI組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，而VRI+活血軟堅(jiān)方(30、100 g·L-1)組flt-1 mRNA表達(dá)量比VRI組明顯升高(P<0.05)；VRI+活血軟堅(jiān)方(10、30、100 g·L-1)組kdr、kdrl mRNA表達(dá)量比VRI組明顯升高(P<0.01)。

Fig 4 Effect of SEHM on mRNA expression of flt-1, kdr, kdrl

1：Control; 2：VRI 100 nmol·L-1; 3～5：VRI+SEHM 10, 30, 100 g·L-1.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsVRI group

3.6活血軟堅(jiān)方對(duì)HUVEC細(xì)胞的毒性作用Fig 5 MTT結(jié)果顯示，活血軟堅(jiān)方水煎液在100、30、10 g·L-1的濃度下，HUVEC細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在300 g·L-1的濃度下，HUVEC細(xì)胞的存活率與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明活血軟堅(jiān)方水煎液300 g·L-1的濃度對(duì)HUVEC細(xì)胞有毒性作用。

Fig 5 Toxicity of SEHM on HUVECs

*P<0.05vscontrol group

3.7活血軟堅(jiān)方對(duì)HUVEC細(xì)胞的促增殖作用Fig 6 MTT結(jié)果表明，活血軟堅(jiān)方水煎液在30、10 g·L-1的濃度下，HUVEC細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在100 g·L-1的濃度下，HUVEC細(xì)胞的存活率與空白對(duì)照組比較，明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明活血軟堅(jiān)方水煎液(100 g·L-1)對(duì)HUVEC細(xì)胞有促增殖作用。

Fig 6 Promoting proliferation effect of SEHM on HUVECs

*P<0.05vscontrol group

3.8活血軟堅(jiān)方對(duì)HUVEC血管新生相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Fig 7所示，與對(duì)照組比較，活血軟堅(jiān)方100 g·L-112 h組Akt和p38的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)，而活血軟堅(jiān)方100 g·L-16、24 h組Akt和p38的表達(dá)量均有明顯升高(P<0.05)。與對(duì)照組比較，活血軟堅(jiān)方100 g·L-16、12 h兩組p-p38、p44/42、p-p44/42的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)，而活血軟堅(jiān)方100 g·L-124 h組的表達(dá)量明顯上升(P<0.05)。與對(duì)照組比較，活血軟堅(jiān)方100 g·L-16 h組VEGFR-1的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)，而活血軟堅(jiān)方100 g·L-112、24 h兩組VEGFR-1的表達(dá)量明顯上升(P<0.01)。

4 討論

隨著對(duì)冠心病不斷深入的研究，治療方案已逐漸從缺血/再灌注向促血管新生轉(zhuǎn)變，通過(guò)移植VEGF到缺血的心肌組織，促使其側(cè)支循環(huán)形成和血管新生，可明顯提高冠心病患者的生活質(zhì)量。血管新生作為冠心病的內(nèi)科治療手段，已成為治療冠心病的一種可能[4]，并在心血管疾病中表現(xiàn)出了積極的治療作用。斑馬魚模型具有建模周期短、直接給藥等優(yōu)點(diǎn)，且重復(fù)試驗(yàn)一致性好、高通量化篩選、與人的遺傳物質(zhì)相似度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近臨床。其模型應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，且已成為藥物篩選的常用手段[2]。張哲睿等[5]和陳錫強(qiáng)等[6]通過(guò)斑馬魚模型研究發(fā)現(xiàn)，三七及三七花總皂苷和熊果酸的促血管新生作用。本課題即是通過(guò)建立斑馬魚模型，發(fā)現(xiàn)活血軟堅(jiān)方能夠有效促進(jìn)血管的新生。

Fig 7 Effect of SEHM on protein expression of Akt, VEGFR-1, p38, p-p38, p44/42, p-p44/42

1：Control; 2～4：SEHM 10, 30, 100 g·L-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

冠心病屬于中醫(yī)“胸痹”、“心痛”、“真心痛”等病范疇。中醫(yī)認(rèn)為，胸痹的成因往往由瘀血和痰實(shí)兩大病理產(chǎn)物導(dǎo)致?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》為中醫(yī)活血化瘀學(xué)說(shuō)之肇始[7]，并提出“血實(shí)宜決之”的治則治法。張仲景在《金匱要略》中指出：“胸痹，不得臥，心痛徹背者，栝樓薤白半夏湯主之”，這是胸痹病的首論，該方也成為后世治療冠心病的經(jīng)典方。此后歷代醫(yī)家逐漸認(rèn)識(shí)到痰濁在胸痹、心痛發(fā)病中的重要性。清代王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》中，創(chuàng)立了以活血化瘀為基本治療原則的血府逐瘀湯，強(qiáng)調(diào)了瘀血既是胸痹病的發(fā)病關(guān)鍵，也是重要的病理產(chǎn)物?；钛龇ǖ奶岢觯矠橹委熜乇圆〉於死碚摵蛯?shí)踐基礎(chǔ)。

近年臨床及文獻(xiàn)報(bào)道均提到，中藥復(fù)方及單體可以促進(jìn)血管的新生[8-10]。其中周忠焱等[11]和趙外榮等[12]分別通過(guò)建立轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型和內(nèi)皮細(xì)胞模型，研究由桂枝、三棱、莪術(shù)組成的通陽(yáng)活血方和由三棱、莪術(shù)組成的活血化瘀方促血管新生作用和機(jī)制研究。這些文獻(xiàn)記載提示了具有“活血化瘀”、“化痰軟堅(jiān)”等作用的中藥及復(fù)方皆有可能具有促血管新生的作用。本課題采用活血軟堅(jiān)方對(duì)血管新生的作用及其機(jī)制研究，是對(duì)活血化瘀和軟堅(jiān)散結(jié)藥物組合促血管新生的進(jìn)一步研究和探索。活血軟堅(jiān)方是嚴(yán)世蕓教授從胸痹治療的用藥經(jīng)驗(yàn)中，結(jié)合自己多年的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來(lái)。對(duì)于胸痹的辨治，嚴(yán)教授在臨床上往往首辨標(biāo)本虛實(shí)，本虛為肝腎不足，氣血虧虛。標(biāo)實(shí)為風(fēng)、火、痰、瘀諸邪相互搏結(jié)，七情勞倦耗傷氣血，久之則澀滯于脈而結(jié)于胸中，所謂不通則痛，即發(fā)為胸痹。對(duì)于標(biāo)本之辨，結(jié)合臨床實(shí)際，往往兩者兼見，且互為標(biāo)本，臨證采取急則治標(biāo)緩則治本。

VEGF及VEGFR對(duì)于血管新生中的作用至關(guān)重要，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖，且能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)皮一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)提高，從而引起血管舒張，提高血管的通透性，達(dá)到血管新生的作用。VEGF有5個(gè)成員，分別為VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF；3種受體分別為VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。VEGF-A主要結(jié)合在VEGFR-1和VEGFR-2上，VEGF-B和PIGF只結(jié)合在VEGFR1上，VEGF-C和VEGF-D只結(jié)合在VEGFR-3上。VEGFR1主要表達(dá)在造血干細(xì)胞上，VEGFR-2主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，VEGFR3主要表達(dá)在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上，所以不同的受體在不同的細(xì)胞上表達(dá)并不一致。而VEGF有3種跨膜受體VEGFR-1(flt-1)、VEGFR-2(在人體中被稱作kdr)和VEGFR-3，故flt-1、kdr、kdrl的表達(dá)也均與血管新生有密切的聯(lián)系。

VEGFR-1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，其調(diào)節(jié)的信號(hào)通路主要在缺血時(shí)造血干細(xì)胞的聚集和遷移中起著重要作用。在VEGF引起的內(nèi)皮細(xì)胞改變中，VEGFR-2是主要參與的受體，且與細(xì)胞的增殖、遷移以及血管的通透性有關(guān)。VEGFR-2及其隨后激活的PI3K可在細(xì)胞膜附件催化PIP2生成PIP3，隨后激活A(yù)kt，直接參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的存活，Akt的表達(dá)還可以在缺血區(qū)誘導(dǎo)產(chǎn)生血管的新生。p44/42和p38均是MAKP家族中重要的亞型，大量研究證明，p44/42信號(hào)通路可因VEGF等細(xì)胞因子通過(guò)絲裂原活化的蛋白激酶信號(hào)途徑而介導(dǎo)細(xì)胞增殖。p38是細(xì)胞信號(hào)傳遞的交匯處，常常參與調(diào)控細(xì)胞的增殖，其通路的作用可根據(jù)不同的細(xì)胞和不同的刺激而完全不同。

根據(jù)“活血化瘀”，“軟堅(jiān)散結(jié)”的中醫(yī)理論，并結(jié)合嚴(yán)世蕓教授在臨床上善用活血軟堅(jiān)藥物治療胸痹心痛的經(jīng)驗(yàn)心得，活血軟堅(jiān)方可促進(jìn)斑馬魚節(jié)間血管損傷的恢復(fù)，其機(jī)制可能與增加斑馬魚體內(nèi)flt-1、kdr、kdrl的mRNA的表達(dá)有關(guān)。活血軟堅(jiān)方可促進(jìn)斑馬魚腸下靜脈血管出芽和交叉的效用，且在100 g·L-1的濃度下可促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與增加細(xì)胞內(nèi)Akt、p38、p-p38、p44/42、p-p44/42、VEGFR-1的表達(dá)量有關(guān)。本研究證明了活血軟堅(jiān)方具有在體內(nèi)和體外的促血管新生作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)VEGFR表達(dá)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院斑馬魚實(shí)驗(yàn)室完成，感謝老師的悉心指導(dǎo)和同學(xué)的幫助！)

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