克里米亞-剛果出血熱病毒新型治療性抗體研制展望

劉 歡(LIU Huan)，張懷東(ZHANG Huai-dong)，陳曉暉(CHEN Xiao-hui)，龔 睿(GONG Rui)

(中國科學院武漢病毒研究所，湖北 武漢 430071)

隨著人們認識的增加，烈性傳染性病毒不斷被發(fā)現(xiàn)和鑒定，高致病性、高傳播性的病毒往往由于變異，導致反復流行。如在非洲和阿拉伯半島多次暴發(fā)1931年首次分離到的裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)[1]；1937年發(fā)現(xiàn)于非洲，并于1999年傳入美國且在多個州暴發(fā)的西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)[2-3]；1944、1956、1965年分別發(fā)現(xiàn)于俄國克里米亞、非洲剛果和我國新疆巴楚地區(qū)的克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus，CCHFV)，1967年分離出該病毒，被我國稱為新疆出血熱病毒(Xinjiang haemorrhagic fever virus，XHFV)[4]。1967年在德國首次發(fā)現(xiàn)馬爾堡病毒(Marburgvirus，MARV)[5]；1976年發(fā)現(xiàn)，隨后在非洲反復暴發(fā)流行的埃博拉病毒(Ebolavirus，EBOV)[6]；1998—1999年在馬來西亞暴發(fā)，2001—2009年連續(xù)在印度和孟加拉國流行的尼帕病毒(Nipahvirus，NiV)[7-8]；2002年底出現(xiàn)，2003年在我國暴發(fā)流行的SARS冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)[9]；2012年出現(xiàn)于沙特阿拉伯，具有高致死率的中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)[10]；2013年在我國多地出現(xiàn)的H7N9型流感病毒[11]。自2009年以來，中國加強了急性發(fā)熱性疾病的監(jiān)測與管理，發(fā)現(xiàn)了一種不明原因的嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)，該病由一種新型病毒引起，命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒，簡稱新布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome visus，SFTSV)[12]。目前，上述病毒感染幾乎沒有特效藥物和疫苗，因此，針對其研制特效藥物，對于提高其防治水平、保障我國國民健康，具有非常重要的意義。

1 克里米亞-剛果出血熱病毒

克里米亞-剛果出血熱最初源于20世紀40年代中亞克里米亞半島，病原體為CCHFV?？死锩讈?剛果出血熱是一種流行于俄國北部、中東、南部歐亞大陸和非洲撒哈拉地區(qū)的烈性傳染性疾病，主要見于無樹的大平原、半沙漠地帶及丘陵地區(qū)，病死率為20%～70%[13]，該病分布具有明顯的地域性[14-18]。1965年在我國新疆南部巴楚地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)此種疾病，CCHFV在我國又被稱為XHFV。新疆出血熱是目前我國發(fā)現(xiàn)的四種蟲媒病毒性傳染病之一[18]。在青海、云南、四川、內蒙、安徽、海南、伊犁、東北等地均有抗體陽性案例的報道，并證實在新疆塔里木盆地、準噶爾盆地、塔里木河，云南騰沖、尋甸、西雙版納和孟連、伊犁河谷邊境地區(qū)、青海等存在XHFV自然疫源地[19]。近年來，新疆出血熱在我國再度暴發(fā)，疫區(qū)不斷擴大，危害日益嚴重。CCHFV屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)的內羅病毒屬(Nairovirus)[20]。根據(jù)第七屆國際病毒學分類委員會報告，內羅病毒屬包括34種由硬蜱科(Ixodidae)或者隱喙蜱科(Argasidae)傳播的病毒，分為七個血清型[21]，其中最重要的是克里米亞-剛果出血熱血清型和內羅畢羊病(Nairobi sheep disease)血清型。內羅畢羊病毒主要感染綿羊和山羊，也可以引起人輕度發(fā)熱和血小板減少[22]。

1968 年Murphy等[23-24]第一次描述了CCHFV在乳鼠腦中具有與其他布尼亞病毒科病毒相似的形態(tài)。在病毒基本結構、形態(tài)發(fā)生、復制循環(huán)以及理化性質等方面，CCHFV可作為布尼亞病毒科的典型代表[20, 25-28]。CCHFV基因組由大(L)、中(M)、小(S)三股負鏈 RNA 片段組成，分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)、糖蛋白(glycoprotein，GP)及核蛋白(nucleoprotein，NP)[29]。三個基因組分別包含一個開放讀碼框，兩側為非編碼區(qū)。每個基因組末端11個堿基是保守的，并且除第9位核苷酸外均互補，在隨后的20個左右堿基顯示片段特異性互補，形成螺絲狀或鍋柄狀結構[30]。

CCHFV mRNA編碼的糖蛋白前體，經(jīng)翻譯后加工成為成熟的G1和G2[31-33]。成熟的G1和G2嵌入脂質層，形成刺突狀結構[34]。蛋白G1和G2也分別稱為Gc和Gn，在介導病毒與受體結合，進入宿主細胞中起關鍵作用，病毒感染后產(chǎn)生的中和性抗體也主要靶向該區(qū)域[35]。成熟的糖蛋白能識別易感宿主細胞上的受體并能誘導中和抗體的產(chǎn)生[36]。Gn只在病毒成熟的末期產(chǎn)生，目前研究[37]認為，Gn主要起分子伴侶作用，幫助Gc正確折疊，而Gc介導了與受體的結合，其潛在受體可能是核仁素(nucleolin)。

CCHFV由蜱蟲叮咬傳播，重癥患者的血液與排泄物也具有傳染性。該病毒具有傳播迅速、致死率高、暫無有效治療藥物[35, 38-39]等特點，開發(fā)針對CCHFV的特效藥物，對于提高我國對該病毒的防治水平，保障國民健康具有十分重要的意義。

2 治療性抗體

生物治療中的蛋白質類大分子藥物通常包括生長因子、受體、酶、血液因子、抗凝血劑、重組疫苗、融合蛋白和單克隆抗體等，而單克隆抗體則越來越受到人們的關注[40]。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已經(jīng)批準三十多種單克隆抗體用于治療各種疾病，如癌癥、免疫系統(tǒng)疾病等[41]。2001年以來，治療性抗體的市場以每年35%的速度增長，是生物類藥物中增長最快的[19]。近年來，一些大的制藥公司也在收購其他抗體公司方面展開激烈競爭，如AstraZeneca公司于2007年花156億美元巨資買下MedImmune公司，而后者的主打產(chǎn)品之一是一種預防呼吸道合胞病毒感染的單克隆抗體Palivizumab(商品名Synagis)[42]，由此可見治療性抗體的重要性。

治療性抗體的顯著優(yōu)勢是其天然存在于人體內，相對安全，同時具有功能強大和靶向性高的特點，為治療目前難以攻克的疾病帶來新的希望。如最近鑒定一系列針對人免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)的具有廣譜中和活性的抗體(如VRC01[43-44])，有的已進入一、二期臨床試驗(如PRO140[45-46]和TNX-355[47-48])，顯示出治療性抗體在防治HIV-1上具有很好的應用前景[49-50]。

然而，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)全長抗體的分子量較大(～150 kD)，組織(如實體瘤)滲透性較差，也難以結合一些空間上有位阻效應的關鍵表位(如病毒囊膜蛋白上的中和性位點)，從而影響活性。解決的策略之一是將全長抗體進行小型化[51]，由此開發(fā)了一系列具有結合功能的抗體片段，如Fab(50～60 kD)、單鏈抗體(scFv，20～30 kD)、重鏈可變區(qū)抗體(VH，12～15 kD)(單域抗體)等小型化抗體。上述抗體片段相對于全長單抗，具有更好的組織滲透性和結合存在位阻效應的抗原表位的能力，有些甚至能夠口服用藥。目前，基于人重鏈可變區(qū)VH的單域抗體已經(jīng)被用于研發(fā)針對病毒的候選抗體類藥物[48, 51]。已有開發(fā)以抗體Fc片段的CH2結構域為骨架的單域抗體，稱之為納米抗體。該納米抗體的分子量與VH形式的單域抗體相似，但是具有相對較長的血漿半衰期[52]。

已有研究[53]表明，病毒感染后產(chǎn)生的抗體對CCHFV具有中和作用，并且主要靶向病毒的囊膜蛋白。因此，通過抗體工程技術篩選出針對該病毒囊膜蛋白具有中和活性的單域抗體dAb或者nAb，有望開發(fā)成一類新的抗CCHFV的候選抗體藥物。

3 中和活性評價系統(tǒng)

皰疹口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)是典型的帶有包膜蛋白的動物病毒，由于其龐大的宿主范圍，并能在很多哺乳動物細胞和昆蟲細胞中穩(wěn)定地復制，被廣泛地應用于研究中。VSV組裝使用時是刪除了糖蛋白G基因的重組VSV。重組rVSV-ΔG與異源病毒包膜蛋白一起生成VSV假病毒顆粒[54]。已有研究構建了以VSV為基礎的假病毒體系VSV-CCHFVG[55]。首先在293FT細胞內分別表達CCHFV糖蛋白前體G和β-半乳糖苷酶(作為對照)，然后用帶有螢火蟲熒光素酶報告基因的委內瑞拉馬腦炎病毒糖蛋白(VSV-VEEVGP，Venezuelan equine encephalitis virus glycoprotein)假病毒侵染細胞。委內瑞拉馬腦炎病毒糖蛋白VEEVGP在細胞內很快降解，VSV核心復制、組裝的子代病毒將帶有CCHFV糖蛋白，形成VSV-CCHFVG假病毒。侵染48 h后收集病毒，加入到SW13單層細胞中，通過測螢火蟲熒光素酶酶活性評估病毒的滴度。在缺少高等級生物安全實驗室的情況下，CCHFV模型的建立使得體外穩(wěn)定、高效地獲得感染性病毒顆粒并用于中和抗體的檢測與評價成為可能。

4 囊膜蛋白分類與抗原設計

目前，依據(jù)病毒囊膜蛋白融合前后的結構模式，將病毒囊膜蛋白分為三類：ClassI、ClassII和ClassIII。ClassI型囊膜蛋白分類的依據(jù)主要是其均能形成一個含有α-螺旋的卷曲螺旋結構中心的發(fā)夾三聚體；ClassII型囊膜蛋白分類的依據(jù)主要是其均能形成含有β-折疊結構的發(fā)夾三聚體[56-64]。ClassIII型囊膜蛋白也能通過兩部分結構的組合，形成發(fā)夾三聚體(與ClassI型囊膜蛋白類似)，融合后的三聚體也含有α-螺旋三聚體核心；然而每個融合區(qū)域暴露出兩個位于延長的β-折疊頂端的融合環(huán)，顯著的表現(xiàn)出與ClassII型囊膜蛋白結構上的類似之處[65-67]。已有預測研究[64,68]表明，CCHFV的囊膜蛋白Gc屬于ClassII型囊膜蛋白。雖然這類蛋白缺少明顯的保守氨基酸序列，但是其二級結構和三級結構是保守的，結構非常相似。

使用TMHMMServer(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預測CCHFV囊膜蛋白Gc在胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)的分布?？缒^(qū)和胞內區(qū)因存在空間位阻，不能成為其功能性表位。然后用NetNGlyc對囊膜蛋白糖基化位點進行預測，糖基化對表位形成有一定影響，可能會改變或形成新的表位。利用兩個抗原表位預測服務器，(1)ClusPro: protein-protein docking/Antibody Mode(http://cluspro.bu.edu)；(2)MIF Bioinformatics: Predicted Antigenic Peptides(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html)，聯(lián)用親水性、柔韌性、可及性、轉角等多參數(shù)進行抗原表位預測。綜合考慮跨膜區(qū)和抗原表位預測結果及囊膜蛋白的高度變異區(qū)，確定分段表達策略，逐步縮小抗原表位區(qū)域。表達、純化這些結構域，可以作為抗體篩選的靶點。

5 展望

中和性抗體是烈性病毒感染防控的特效藥物，如已經(jīng)研制出的針對EBOV的抗體藥物ZMapp，取得了很好的效果。目前，已有的針對烈性病毒的中和抗體多為全長單克隆抗體(主要為IgG形式)，分子量大，不容易結合大分子(如病毒囊膜蛋白)上空間存在位阻效應的關鍵表位；而且結構復雜，需在哺乳動物細胞中表達，制備周期長，一般情況下需要在低溫儲存，難以適用于復雜環(huán)境。

相對于全長克隆抗體、Fab和scFv，單域抗體(包括dAb和nAb)能更有效靶向病毒囊膜蛋白上那些關鍵而狹小的保守區(qū)域，發(fā)揮中和活性；富含β折疊，結構簡單可原核表達，易于制備，常溫下仍保持穩(wěn)定，適宜在復雜的環(huán)境中儲存和使用；篩選能夠中和CCHFV的單域抗體，有望開發(fā)出抗CCHFV的新候選藥物，單域抗體具有廣闊的應用前景。