肺癌干細(xì)胞作為靶點(diǎn)的肺癌治療策略研究進(jìn)展

賴紅錦 林鋒 陳楠 文舒 胡曉 劉倫旭

根據(jù)2016年公布的數(shù)據(jù)，在各種類型的癌癥中，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居于前列[1]。近30年來，肺癌5年生存率雖逐步上升，但仍然低于30%，其嚴(yán)峻形勢不容樂觀。癌癥干細(xì)胞（cancer stem cell, CSC）理論認(rèn)為惡性腫瘤發(fā)生可能是具有自我更新及分化能力的干細(xì)胞導(dǎo)致[2,3]。在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，肺癌干細(xì)胞可能扮演了重要的角色，在腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、抗化療藥物等方面發(fā)揮作用[4-8]。本文就以肺癌干細(xì)胞（lung cancer stem cell, LCSC）為靶點(diǎn)的治療策略的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物

目前對于肺癌干細(xì)胞的標(biāo)志物的認(rèn)定尚無明確標(biāo)準(zhǔn)，但是存在一些在肺癌干細(xì)胞中廣泛表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白或酶等被廣泛認(rèn)可為陽性標(biāo)志物，如CD133、CD166以及ALDH等[7-9]；此外，CD24、CD45等標(biāo)志物在肺癌干細(xì)胞中呈陰性或低表達(dá)[10]，被認(rèn)為是陰性標(biāo)志物，無法作為靶點(diǎn)。

1.1 CD133 CD133也稱人Prominin-1，是一種5次跨膜的糖蛋白，由865個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約97 kDa[11]。CD133在肝癌、腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌中都被證實(shí)為癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物[8]，且其陽性表達(dá)與LCSC關(guān)系密切。Tirino等[12]對非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）樣本的細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)分析，并將培養(yǎng)結(jié)果與臨床標(biāo)本比對，研究發(fā)現(xiàn)CD133陽性細(xì)胞比例顯著增加，提示其增殖能力強(qiáng)于其他細(xì)胞。Hilbe等研究[13]顯示，NSCLC臨床樣本中CD133陽性細(xì)胞的增加與腫瘤組織血管生成具有相關(guān)性。Eramo等研究[14]結(jié)果顯示，CD133陽性細(xì)胞注入SCID小鼠皮下增殖分化產(chǎn)生與原腫瘤表型相同的腫瘤，且CD133與Ep-CAM的共表達(dá)可能與腫瘤的血管內(nèi)皮發(fā)生有關(guān)。

1.2 ALDH ALDH（aldehyde dehydrogenases），即乙醛脫氫酶，負(fù)責(zé)催化乙醛等物質(zhì)的氧化脫氫等重要反應(yīng)，ALDH對視黃醛氧化具有極高效的催化作用，這對組織細(xì)胞的分化調(diào)控具有重要作用[15]。ALDH在白血病、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等的癌癥干細(xì)胞中都異?；钴S[8]，可作為不良預(yù)后的指標(biāo)[16]。Moreb等通過對不同肺癌細(xì)胞系進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)ALDH1A1和ALDH3A1兩種亞型在某些NSCLC細(xì)胞系中高表達(dá)[17,18]。Ucar等[19]通過對H522肺癌細(xì)胞系A(chǔ)LDH表達(dá)程度不同的細(xì)胞分類研究，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)ALDH的一類細(xì)胞呈現(xiàn)出類似干細(xì)胞的特征：增殖較緩慢，可產(chǎn)生具形態(tài)學(xué)差異的不同集落，在NOD/SCID（非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷）小鼠中的初代移植瘤生長緩慢等。而直接從NSCLC標(biāo)本中分離的ALDH1陽性細(xì)胞，在體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均呈現(xiàn)出一系列癌癥干細(xì)胞特征[20]。

1.3 ABCG2 ABCG2是隸屬于ABC蛋白家族的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在正常組織廣泛分布，干細(xì)胞中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞多重耐藥具有相關(guān)性[21,22]。ABCG2在結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等腫瘤中均可作為CSC標(biāo)志物[21-23]。Ho等[24]從H460、H23、HTB-58、A549、H441、H2170六種肺癌細(xì)胞系中分離出的側(cè)群細(xì)胞（side population, SP）均高表達(dá)ABCG2，因而ABCG2被認(rèn)為是SP的表型；同時(shí)該研究證實(shí)SP在NOD/SCID小鼠中具有比非SP更強(qiáng)的致瘤作用，SP中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶高表達(dá)，提示肺癌的側(cè)群細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性。Sung等[25]將從A549肺癌細(xì)胞系中分離的SP用ABCG2的選擇性抑制劑煙曲霉毒素處理后，SP全部消失；利用基因芯片技術(shù)對SP的ABCG2的mRNA表達(dá)進(jìn)行測定，也顯示出高表達(dá)的結(jié)果。

1.4 CD44 CD44是一種跨膜糖蛋白，作為信號受體發(fā)揮介導(dǎo)細(xì)胞粘附、遷徙等多種功能，有研究表明其在結(jié)直腸癌中可作為CSC標(biāo)志物[8]。Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，CD44陽性肺癌細(xì)胞中Nanog基因高表達(dá)，而Nanog基因則在干細(xì)胞獲得多潛能的過程中發(fā)揮極為重要的作用[27]。作為一種重要的信號受體，CD44可介導(dǎo)腫瘤的增殖，如作為表皮生長因子受體或ErbB家族其他受體酪氨酸激酶的共受體，間接激活細(xì)胞增殖[8]。Leung等[28]研究證實(shí)了CD44陽性NSCLC細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)分化的能力，且新分離的CD44陽性細(xì)胞比陰性細(xì)胞對順鉑治療有著更強(qiáng)的抗性。

1.5 其他 除上述幾種認(rèn)可度較高的標(biāo)志物外，一些研究證實(shí)，CD166也在LCSC中表達(dá)較為活躍。CD166屬于細(xì)胞粘附分子免疫球蛋白超家族（Ig-CAM），介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附等功能，與白細(xì)胞滲出有密切關(guān)系；Zhang等[29]從肺部腫瘤中分選出腫瘤起始細(xì)胞（tumor-initiating cell, TIC）亞群，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD166陽性的細(xì)胞具有比CD166陰性細(xì)胞更強(qiáng)的致瘤能力。

需要特別指出的是，LCSC往往存在多種標(biāo)志物共表達(dá)的情況，有學(xué)者認(rèn)為單個(gè)的標(biāo)志物不足以作為LCSC的證據(jù)，需要多重標(biāo)志物對LCSC進(jìn)行定義[8]。

2 肺癌干細(xì)胞的調(diào)控信號通路

盡管積累了較多腫瘤細(xì)胞調(diào)控信號通路相關(guān)基因的變異的資料，但目前肺癌的腫瘤異質(zhì)性以及耐藥性的具體產(chǎn)生機(jī)制仍不十分清楚[9]。隨著對以下幾種信號通路與腫瘤發(fā)生、腫瘤耐藥之間相關(guān)性的研究逐步深入，有理由相信，與胚胎發(fā)育或分裂分化相關(guān)的信號通路的異常激活和腫瘤的發(fā)生及惡性轉(zhuǎn)移有較強(qiáng)聯(lián)系[8]。

2.1 Notch通路 人類共有四種Notch受體，Notch信號通路在胚胎發(fā)育調(diào)控及其他多種生物功能中發(fā)揮重要作用，其變異對于CSC的產(chǎn)生和維持可能有著重要的促進(jìn)作用。Westhoff等[30]發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中，約1/3的樣本存在著Notch通路的變異，并確定兩種變異類型：Numb表達(dá)的缺失和Notch-1功能獲得性突變。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）可使癌細(xì)胞獲得干細(xì)胞樣特性和耐藥性等，Notch通路與多種轉(zhuǎn)錄因子間的交流可加強(qiáng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，促使NSCLC獲得更高的運(yùn)動(dòng)性、侵襲力及代謝活力[31]。Hassan等[32]研究發(fā)現(xiàn)，Notch活性高的肺腺癌細(xì)胞能在無血清培養(yǎng)基中形成更多的腫瘤球并可分化出Notch低活性的細(xì)胞群體，其中高活性的細(xì)胞對化療有抗性且在NOD/SCID小鼠移植試驗(yàn)中表現(xiàn)致瘤性；在使用了Notch通路阻斷劑（γ-分泌酶抑制劑，GSI）后，Notch通路下游信號表達(dá)減弱，移植瘤無法在NOD/SCID小鼠中再植，形成新的移植瘤；其研究結(jié)果表明，高Notch活性與致瘤性和腫瘤耐藥性等有關(guān)，其抑制劑有潛在的治療價(jià)值。

2.2 Hedgehog通路 Hedgehog通路在胚胎發(fā)育中起到重要作用，在成體組織的修復(fù)與再生中處于中心地位。Hedgehog通路的調(diào)節(jié)異常與腦部、皮膚、胃腸道及胰腺的癌癥均有聯(lián)系[33]。Hedgehog通路涉及三種配體：Dhh、Shh、Ihh；兩類轉(zhuǎn)錄因子：Ci、Gli；正常情況下，該通路由Gli1介導(dǎo)的正反饋環(huán)和PTCH1，PTCH2，HHIP1介導(dǎo)的負(fù)反饋環(huán)調(diào)控維持穩(wěn)定，其失調(diào)則可能導(dǎo)致癌變[34]。Watkins等[35]發(fā)現(xiàn)Shh和Gli1在肺的氣道上皮損傷修復(fù)中高度活躍，7種SCLC和7種NSCLC細(xì)胞系均表達(dá)Shh；對癌癥組織的Shh和Gli1檢測數(shù)據(jù)顯示，SCLC的組織樣本中50%共表達(dá)Shh和Gli1，NSCLC則僅10%共表達(dá)Shh和Gli1。也有其他研究在40例SCLC樣本中檢出Gli表達(dá)高達(dá)85%[33]。Katoh等[34]發(fā)現(xiàn)Hedgehog通路可與下述的Wnt通路共同誘導(dǎo)CD133和CD44等干細(xì)胞標(biāo)志物，促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換。

2.3 Wnt通路 Wnt通路在多種器官系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)生過程中都扮演了重要角色，參與了多種組織的損傷后再生過程。Wnt通路與組織的癌變也有相關(guān)性，在結(jié)直腸癌，黑色素瘤等中都存在Wnt異常激活[36]。Wnt配體是一類分泌蛋白，其家族中與人類肺癌相關(guān)的主要有Wnt1、Wnt2、Wnt7a、Wnt5a[36]；Wnt通路可分為β-連環(huán)蛋白依賴的經(jīng)典Wnt通路和β-連環(huán)蛋白非依賴的非經(jīng)典Wnt通路；值得一提的是，根據(jù)肺癌類型的不同，非經(jīng)典通路的異常激活可能是腫瘤抑制因素或腫瘤誘發(fā)因素[37]，這與Wnt的激活在其他腫瘤的發(fā)生中的特點(diǎn)不同。He等[38]用阻斷Wnt1和Wnt2信號通路的siRNA或單克隆抗體，都成功誘導(dǎo)了NSCLC細(xì)胞的凋亡。Yang等[37]發(fā)現(xiàn)在肺腺癌A549細(xì)胞系和順鉑耐藥的A549/DDP細(xì)胞系中，Wnt5a都能通過其介導(dǎo)的非經(jīng)典Wnt通路增加ALDH陽性LCSC的干細(xì)胞性，實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了Wnt5a/PKC通路與NSCLC的順鉑耐藥有關(guān)。

2.4 其他通路 另有一些研究[4-7]顯示，除上述幾種通路外，EGFR-Notch通路、STAT3通路、JNK通路和PI3K通路等與肺癌的預(yù)后不良有關(guān)，且伴隨一些CSC標(biāo)志物的表達(dá)，提示其在LCSC產(chǎn)生與維持過程中的作用。此外，Oct4，Sox2和Nanog這三種胚胎干細(xì)胞自我更新的核心轉(zhuǎn)錄因子，都被認(rèn)為與LCSC自我更新過程有密切關(guān)系[7]。

3 與LCSC相關(guān)的治療策略

3.1 針對LCSC標(biāo)記物的靶向治療策略 Hu等[39]研究發(fā)現(xiàn)，麥角黃酮酸D（SAD）可以抑制側(cè)群細(xì)胞的腫瘤球形成能力，而其具體機(jī)制，則是激活鈣蛋白酶1來縮短ABCG2的半衰期，使得ABCG2表達(dá)下調(diào)，且側(cè)群細(xì)胞比例也減少。Niu等[40]用低分子量肝素（low molecular weight heparin,LMWH）處理順鉑耐藥的A549側(cè)群細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LMWH對側(cè)群細(xì)胞的增殖和凋亡過程無顯著影響，但是LMWH極大地降低了側(cè)群細(xì)胞的集落形成能力和ABCG2的表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示，LMWH是通過誘導(dǎo)蛋白酶體介導(dǎo)的ABCG2的降解實(shí)現(xiàn)的上述對SP細(xì)胞的影響，LMWH與順鉑治療的結(jié)合可有效控制腫瘤的耐藥性。To等[41]發(fā)現(xiàn)，對于高熱療法帶來的ABCG2表達(dá)上調(diào)與耐藥性上升，培利替尼（pelitinib）可作為ABCG2的競爭性抑制劑，顯著抑制ABCG2介導(dǎo)的藥物外排導(dǎo)致的耐藥性。Yeh等[42]用三氟拉嗪（trifluoperazine）處理LCSC，降低了LCSC的腫瘤球形成能力，下調(diào)了CD44和CD133的表達(dá)，且三氟拉嗪與吉非替尼（gefitinib）或順鉑結(jié)合使用，可有效控制LCSC耐藥性。根據(jù)ALDH1陽性的LCSC對順鉑治療有耐藥性這一現(xiàn)象，MacDonagh等[43]用DEAB和雙硫侖兩種物質(zhì)靶向ALDH1，恢復(fù)了此類細(xì)胞亞群對順鉑藥物治療的敏感性。此外，近年出現(xiàn)了一些利用納米給藥新方法的靶向治療思路，如Huang等[44]將吉非替尼（gefitinib）裝載到帶有CD133特異性寡核苷酸適配子的納米膠束上，可將藥物靶向輸送到CD133陽性LCSC部位，體外實(shí)驗(yàn)中顯著降低了CD133陽性細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中的比例，且藥物抑制腫瘤球形成。

3.2 針對LCSC信號通路的靶向治療策略 Liu等[45]從A549細(xì)胞系中分離出CD133陽性的LCSC，用γ分泌酶抑制劑DAPT（GSI-IX）阻斷Notch通路，與順鉑治療相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)GSI顯著增強(qiáng)了順鉑的療效；Ma等[46]在H520細(xì)胞系中用GSI阻斷Notch3觀察到類似的效果，且Ma等用特異的siRNA抑制了Notch3通路后，A549和H520的克隆產(chǎn)生能力和腫瘤球形成能力都明顯降低。

Katoh等[34]的研究指出，針對Hedgehog通路的癌癥治療策略，Hedgehog通路抑制劑應(yīng)與RTK通路抑制劑和GPCR通路調(diào)節(jié)劑聯(lián)合使用，因?yàn)楹髢烧吲cHedgehog的激活與抑制密切相關(guān)。Zhu等[47]發(fā)現(xiàn)姜黃素（Curcumin）可同時(shí)抑制Wnt通路及Shh介導(dǎo)的Hedgehog通路的激活，在體外實(shí)驗(yàn)中抑制腫瘤球形成，降低CSC的標(biāo)志物的表達(dá)，誘導(dǎo)CSC的凋亡。Ahmad等[48]證實(shí)Hedgehog通路與NSCLC的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程和埃羅替尼、順鉑耐藥性有關(guān)；研究還表明，針對Hedgehog通路的特異siRNA和該通路的拮抗劑GDC-0449都誘導(dǎo)了CSC標(biāo)志物的下調(diào)，并使得EMT細(xì)胞恢復(fù)對藥物的敏感性；另一項(xiàng)研究[49]中將Hedgehog拮抗劑SANT-1與吉非替尼（gefitinib）共同使用，也明顯抑制了對EGFR-TKI耐藥的NSCLC細(xì)胞致瘤性。

Yang等[37]對Wnt5a/Ca2+/PKC通路加入PKC抑制劑GF109203X后，觀察到順鉑耐藥的肺癌A549/DDP細(xì)胞系凋亡數(shù)目增加，顯示了其對化療抵抗的NSCLC患者的治療價(jià)值。Zhang等[50]從SPC-A1和PC9細(xì)胞系中分離得到LCSC后，用Pyrvinium Pamoate（PP）與其他三種Wnt通路的抑制劑（沙利霉素，ICG-001和水飛薊賓）作為對照進(jìn)行腫瘤細(xì)胞存活試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PP可選擇性地抑制LCSC集落形成，下調(diào)多潛能干細(xì)胞信號通路的表達(dá)水平，其半數(shù)最大抑制濃度遠(yuǎn)低于后三者。You等[51]制備了Wnt-2蛋白N末端的單克隆抗體（mAb），并證實(shí)其可誘導(dǎo)高表達(dá)Wnt-2的NSCLC細(xì)胞系凋亡，對缺乏Wnt-2表達(dá)的正常氣道組織細(xì)胞則不誘導(dǎo)凋亡；同時(shí)，靶向Wnt-2基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的siRNA也成功誘導(dǎo)了NSCLC細(xì)胞系的凋亡；研究還發(fā)現(xiàn)，在mAb和siRNA誘導(dǎo)的NSCLC中均觀察到了生存素蛋白表達(dá)下調(diào)，提示該蛋白在Wnt通路中的重要性，或可作為治療靶點(diǎn)。

3.3 抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 EMT對于癌細(xì)胞的遷徙與入侵有著重要的作用，LCSC的一些異常信號通路會(huì)促進(jìn)肺癌的EMT過程激活[31,34]，因此抑制EMT通路的激活也是一種潛在的治療策略。Met通路對EMT有促進(jìn)作用，PHA-665752和PF-2341066（克唑替尼，crizotinib）可阻斷Met的磷酸化過程，逆轉(zhuǎn)SCLC的耐藥性；對H69M細(xì)胞系，體外實(shí)驗(yàn)分別用依托泊苷（Etoposide），克唑替尼以及兩者聯(lián)合進(jìn)行治療，結(jié)果表明兩者聯(lián)合對Met的抑制作用更強(qiáng)，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)兩者聯(lián)合對腫瘤生長的抑制效果比各自單獨(dú)使用更為明顯，提示克唑替尼恢復(fù)了已產(chǎn)生耐藥性的癌細(xì)胞對藥物的敏感性[52,53]。Li等[54]設(shè)計(jì)并合成了一種具有雙重特異性的抗體（BsAb-5），靶向CD166陽性的LCSC中的c-MET（細(xì)胞-間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子）及CTLA-4（細(xì)胞毒T細(xì)胞相關(guān)蛋白4）雙重位點(diǎn)，體外實(shí)驗(yàn)顯示c-MET-Notch通路被抑制，且BsAb-5使小鼠的移植瘤體積明顯縮小。

3.4 針對LCSC的免疫療法 上述各種針對LCSC的靶向治療策略均涉及到小分子抑制劑、單克隆抗體和RNA等，事實(shí)上近年來針對CSC的疫苗療法也有一定進(jìn)展。Lu等[55]利用黑素瘤和鱗狀細(xì)胞癌的CSC裂解產(chǎn)物沖擊致敏樹突狀細(xì)胞（DC），這種CSC-DC疫苗能限制小鼠的腫瘤生長，減少肺轉(zhuǎn)移，延長生存期，并證實(shí)該沖擊過程與CSC-DC啟動(dòng)的B細(xì)胞分泌IgG，靶向高表達(dá)ALDH的CSC的有關(guān)；該疫苗顯著減少了原發(fā)瘤中的CSC數(shù)目，對于傳統(tǒng)抗癌治療后的局部或全身性復(fù)發(fā)可能有重要的臨床價(jià)值。此外，目前針對NSCLC和SCLC的各種疫苗大都基于腫瘤相關(guān)抗原引起的免疫應(yīng)答，這些經(jīng)驗(yàn)將會(huì)極大地推動(dòng)LCSC相關(guān)免疫療法的發(fā)展[56,57]。

4 結(jié)論與展望

肺癌干細(xì)胞的研究已經(jīng)積累了較多的資料，但LCSC的一些生物學(xué)特性尚未透徹：不同類型肺癌的CSC的分辨特征的差異，逃避放化療的具體機(jī)制以及其自我更新功能的推動(dòng)因素等。并且，NSCLC的異質(zhì)性導(dǎo)致其CSC缺乏具有普遍鑒別作用的特異性標(biāo)志物，這將對LCSC的概念運(yùn)用于肺癌治療造成巨大的障礙。雖然上述一些藥物在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出非常有效的殺滅或抑制LCSC的作用，但仍需大量的工作去評估其對人體正常細(xì)胞的毒害作用，并且需要設(shè)法盡量降低其毒副作用才有望在臨床上使用。毋庸置疑地是，腫瘤治療需要多種治療策略相互配合，對肺癌來說，針對LCSC的策略只是其中一種前景廣闊的思路。