異鉤藤堿保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的藥理研究進(jìn)展

延沁儒，王春梅

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 生理學(xué)教研室，廣東 珠?！?19000)

茜草科鉤藤屬植物是中國(guó)、馬來(lái)西亞、菲律賓、非洲和東南美洲等地重要的民間藥材，全世界有34種，用于治療哮喘、風(fēng)濕、高熱、高血壓和頭痛等疾病。鉤藤內(nèi)含吲哚生物堿、三萜類化合物、黃酮類化合物、苯酚類化合物和苯丙素類化合物；其中吲哚生物堿被認(rèn)為是抗高血壓、癲癇、抑郁、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的主要藥效成分[1]。異鉤藤堿(Isorhynchophylline,IRN)是鉤藤中主要的四環(huán)羥吲哚生物堿，具有與鉤藤類似的藥理活性。以往的研究表明，IRN具有降血壓、抑制血管平滑肌增殖、抑制心率以及抗血栓形成等心血管保護(hù)作用，且易透過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及壁細(xì)胞制作的血腦屏障模型，可能是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的活性藥理成分[2-3]。隨著人口老齡化的日趨嚴(yán)重，AD、PD、腦缺血再灌注損傷的患病率逐年增高，嚴(yán)重危害人類健康。因此，本文主要對(duì)IRN的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行概述，為臨床治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供參考。

1　異鉤藤堿抗實(shí)驗(yàn)性阿爾茨海默病的藥理作用機(jī)制

AD 于1907年首次被阿洛伊斯阿爾茨海默描述，在患者大腦中發(fā)現(xiàn)淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)，是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、記憶減退和人格改變?yōu)榕R床特征的神經(jīng)退行性疾病[4]。AD特征性病理學(xué)改變包括細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(amyloid beta protein,Aβ)沉積寡聚形成的老年斑、細(xì)胞內(nèi)tau蛋白超磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles,NFTs)以及突觸功能異常[5-6]。針對(duì)AD的治療，抗Aβ聚集、增強(qiáng)Aβ清除、減少tau蛋白磷酸化、抗氧化、抗炎等方面的藥物均是研發(fā)熱點(diǎn)。

1.1異鉤藤堿拮抗β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性Aβ是AD的起始因子，由β-分泌酶和γ-分泌酶切割淀粉樣前體蛋白(amloid precursor protein,APP)產(chǎn)生，主要致病的是可溶性Aβ40和更為纖維化的Aβ42寡聚體，最近發(fā)現(xiàn)由η-分泌酶切割A(yù)PP也會(huì)產(chǎn)生具神經(jīng)毒性的Aβ1-16肽[7]。Aβ大量沉積聚集，直接損傷細(xì)胞膜誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，釋放活性氧(active oxygen,ROS)致使線粒體凋亡、介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

一些對(duì)ROS有反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子如熱休克因子-1和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)可與APP基因的啟動(dòng)子位點(diǎn)結(jié)合誘導(dǎo)APP表達(dá)，氧化應(yīng)激通過(guò)激活氨基末端蛋白激酶(c-JunN-terminal protein kainse,JNK)途徑誘導(dǎo)β-分泌酶活性增加，使之產(chǎn)生更多Aβ[8]。研究表明，IRN預(yù)處理Aβ25-35干預(yù)的PC12細(xì)胞可顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS、 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平，谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量大大提升，顯著增強(qiáng)抗氧化能力[9]。在D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠實(shí)驗(yàn)中，口服IRN連續(xù)8周后，小鼠腦組織中GSH濃度明顯增加，超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性提高，MDA濃度下降[10]。還有研究者通過(guò)紫外、質(zhì)譜、核磁共振和光譜實(shí)驗(yàn)等方法鑒定，發(fā)現(xiàn)IRN的代謝產(chǎn)物MO對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞死亡有神經(jīng)保護(hù)作用[11]。

1.2異鉤藤堿抑制線粒體凋亡線粒體功能障礙已被確定為AD發(fā)病機(jī)制中的早期事件，并且通過(guò)新陳代謝減少、Ca2+動(dòng)態(tài)平衡破壞、ROS水平增加、脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞凋亡發(fā)揮致病作用[4]。IRN預(yù)處理能減輕 Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性，從而抑制線粒體凋亡通路保護(hù)神經(jīng)功能[12]。研究表明，糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK-3β)的超活化誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞死亡，IRN可抑制GSK-3β活化，且IRN能增強(qiáng)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated-cAMP response element-binding protein,p-CREB)(Ser133)表達(dá)從而上調(diào)抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤2基因(B-cell lymphoma2,Bcl2)活性[13]。在Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡中，IRN顯著逆轉(zhuǎn)Bcl-2與Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)比值和mRNA水平，并抑制細(xì)胞色素C的釋放[14]。此外，眾所周知，細(xì)胞凋亡需要半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate specific proteases,Caspase)家族參與，細(xì)胞色素C可介導(dǎo)上游的啟動(dòng)子Caspase-2/-8/-9/-10自身活化，使效應(yīng)蛋白Caspase-3/-6/-7執(zhí)行凋亡，研究證實(shí)，IRN能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Caspase-9、Caspase-3蛋白質(zhì)和mRNA水平[13-15]。

1.3異鉤藤堿對(duì)tau蛋白磷酸化的影響高度磷酸化的tau蛋白(p-tau)對(duì)AD中經(jīng)典的纖維聚集起關(guān)鍵作用，突觸功能障礙和神經(jīng)元死亡受其異常構(gòu)象調(diào)節(jié)，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)tau過(guò)表達(dá)損害軸突運(yùn)輸，導(dǎo)致線粒體分布異常，還可調(diào)節(jié)線粒體裂變/融合蛋白來(lái)?yè)p害線粒體動(dòng)力學(xué)，進(jìn)一步引起線粒體功能障礙和神經(jīng)元損傷[16]。據(jù)報(bào)道GSK-3β在完整細(xì)胞的多個(gè)位點(diǎn)磷酸化tau蛋白[17]。IRN可從Thr308、Ser473位點(diǎn)激活磷脂酰肌醇-3 激酶 (phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K) /蛋白激酶 B (protein kinase B,PKB)信號(hào)通路以抑制Ser9位點(diǎn)的GSK-3β活化[13]。tau蛋白在Thr205、Ser396和Ser 404位點(diǎn)的過(guò)度磷酸化可能引起配對(duì)螺旋絲狀體的聚集體和微管細(xì)胞骨架不穩(wěn)定，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和區(qū)域特異性神經(jīng)變性，IRN可在上述幾個(gè)位點(diǎn)抑制tau蛋白過(guò)度磷酸化，IRN對(duì)Aβ誘導(dǎo)的tau蛋白過(guò)度磷酸化的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制GSK-3β活性和激活PI3K /PKB信號(hào)通路密切相關(guān)[11]。

1.4異鉤藤堿抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙會(huì)破壞神經(jīng)元的正常生活環(huán)境，因?yàn)橥挥|傳遞和信息處理失敗導(dǎo)致與認(rèn)知功能密切相關(guān)的神經(jīng)回路損失，可能是認(rèn)知障礙的始動(dòng)因素。Aβ通過(guò)α7煙堿乙酰膽堿受體觸發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣瞬時(shí)信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，引起氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒性，產(chǎn)生趨化因子和炎癥因子，隨后發(fā)生神經(jīng)元死亡[18]。據(jù)報(bào)道在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠胸腺N9細(xì)胞中，IRN通過(guò)阻斷NF-κB、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38 MAPK)等信號(hào)通路抑制如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素1β等促炎癥因子的產(chǎn)生[19]。在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，IRN減弱一氧化氮合酶mRNA的表達(dá)，抑制炎性介質(zhì)的釋放[20]。IRN能有效抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。

2　異鉤藤堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性帕金森病的藥理作用機(jī)制

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二大神經(jīng)退行性疾病，以運(yùn)動(dòng)遲緩、靜息性震顫、肌肉強(qiáng)直和位置不穩(wěn)定為臨床特點(diǎn)，病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中路易體堆積[21]。α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)、鈣離子和多巴胺之間的協(xié)同作用可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)平衡失調(diào)和神經(jīng)元的選擇易感性。

2.1異鉤藤堿誘導(dǎo)α-突觸核蛋白自噬α-syn是路易體的主要成分，基因組的二聚體或三聚體突變導(dǎo)致其過(guò)度表達(dá)，點(diǎn)突變(A53T和A30P)增加α-syn的聚集。易聚集的蛋白如α-syn、tau和突變型亨廷頓蛋白，在很大程度上依賴泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體途徑清除[22- 23]。已證實(shí)IRN以劑量依賴型方式誘導(dǎo)自噬并未阻斷自噬體成熟，在N2a、PC12和SH-SY5Y細(xì)胞中增加自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3-II的水平；誘導(dǎo)果蠅L3幼蟲脂肪體自噬；通過(guò)誘導(dǎo)自噬促進(jìn)了野生型(WT)和突變體(A53T和A30P)N2a細(xì)胞中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)α-syn的清除。此外，IRN促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化的多巴胺能神經(jīng)元中α-syn的降解，不影響自噬激活因子Beclin 1的表達(dá)，但Beclin 1 siRNA基因被敲除時(shí)可完全阻斷IRN誘導(dǎo)的自噬[14]。

2.2異鉤藤堿拮抗1-甲基-4-苯基吡啶誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridine,MPP+)被多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收到多巴胺神經(jīng)元中，通過(guò)影響呼吸鏈復(fù)合物I活性，在線粒體上發(fā)揮神經(jīng)毒性作用[24]。細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)硫氧還蛋白-1(thioredoxin-1,Trx1)在硫氧還蛋白氧化還原酶(thioredoxin reductase,TrxR)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(triphosphopyridine nucleotide,NADH)存在的情況下通過(guò)清除ROS來(lái)發(fā)揮抗氧化特性，在IRN作用下，MPP +誘導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞中TrxR酶活性和Trx1蛋白表達(dá)增加以及顯著減弱MPP +誘導(dǎo)的氧化型酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD+)和NAD + / NADH比率。IRN還可激活轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)和抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)組成的Nrf2-ARE抗氧化系統(tǒng)，通過(guò)ARE的順式作用序列轉(zhuǎn)錄各種抗氧化基因提供細(xì)胞保護(hù)作用。轉(zhuǎn)錄因子BTB-CNC同源體(BTB and CNC homology1,Bach1)與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合II階段抗氧化酶啟動(dòng)子ARE以及Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)與簇集蛋白3(clusterin3,CLU3)組裝形成泛素連接酶E3復(fù)合物以降解Nrf2，IRN可能調(diào)節(jié)Bach1和Keap1蛋白的表達(dá)，并抑制GSK-3β和酪氨酸蛋白激酶磷酸化，進(jìn)而阻斷Nrf2核降解，介導(dǎo)Nrf2核積累誘導(dǎo)ARE驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄并減弱體外氧化應(yīng)激[25]。

3　異鉤藤堿對(duì)動(dòng)物腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

大腦是很脆弱的器官，缺血會(huì)導(dǎo)致局限性腦組織壞死，快速恢復(fù)血流量是中風(fēng)最重要的療法，但是腦缺血不完全阻斷30 min后再恢復(fù)正常，又會(huì)發(fā)生缺血-再灌注損傷，對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)元“保護(hù)”或“修復(fù)”，減少神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡作為治療腦缺血的潛在策略[26]。將海馬切片暴露于缺氧和缺糖的培養(yǎng)基中8min通過(guò)電刺激跨越-突觸誘導(dǎo)體外缺血，IRN減少了毒蕈堿受體和5-羥色胺2受體(5-hydroxytrptamine,5-HT2)介導(dǎo)的電流反應(yīng)以及對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)離子型谷氨酸受體具有非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用，結(jié)果表明這些生物堿通過(guò)阻止NMDA、毒蕈堿M1介導(dǎo)的缺血神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護(hù)作用[27]。在永久性大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后，IRN改善了神經(jīng)缺陷和腦水腫，減少梗塞體積，增加緊密連接蛋白claudin-5和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BNDF)表達(dá)。IRN可以通過(guò)激活PI3K/PKB信號(hào)通路，同時(shí)抑制Toll受體(Toll-like receptors,TLRs)/核因子κB(NF-κB)通路保護(hù)腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷[28]。

4　異鉤藤堿抗小鼠抑郁樣作用的藥理機(jī)制

單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)是位于線粒體外膜內(nèi)的黃素酶，催化去甲腎上腺素(noradrenaline,NE)和 5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)和膳食胺的脫氨基，導(dǎo)致其功能不足引起抑郁癥[29]。尾部懸吊和強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)被廣泛用于篩查抗抑郁藥的活性，同時(shí)測(cè)定IRN對(duì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平和MAO活性的影響來(lái)探索其作用機(jī)制。以10、20、40 mg/kg IRN灌胃7d的小鼠在強(qiáng)制游泳和尾部懸浮測(cè)試中不動(dòng)的時(shí)間呈劑量依賴型減少，而IRN在曠場(chǎng)測(cè)試中不刺激小鼠運(yùn)動(dòng)活性。此外，IRN治療拮抗利血平誘導(dǎo)的上瞼下垂，低溫和抑制小鼠運(yùn)動(dòng)活性并顯著增加NE和5-HT水平以及抑制小鼠海馬和額葉中MAO-A的活性。這些結(jié)果表明，IRN通過(guò)抑制MAO發(fā)揮部分抗抑郁樣作用[30]。

5　展望

作為中藥鉤藤的主要有效成分之一，IRN在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的治療方面具有某些獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，對(duì)AD、PD、腦缺血再灌注損傷、抑郁癥等疾病均有一定影響。但I(xiàn)RN藥理作用的分子機(jī)制有待進(jìn)一步探究，目前相關(guān)IRN劑型、藥代動(dòng)力學(xué)、毒副作用方面的研究也較少。且IRN的藥理作用報(bào)道僅局限于細(xì)胞及動(dòng)物層面，還未見(jiàn)相關(guān)的臨床報(bào)道。IRN具有較強(qiáng)的藥理活性，研發(fā)新藥有一定的價(jià)值，需要在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上進(jìn)行臨床應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。