小麥幾個多效抗病基因的利用現(xiàn)狀及展望

李 瑋，宋國琦，張榮志，李玉蓮，張淑娟，高 潔，李根英

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/小麥玉米國家工程實驗室，山東濟南 250100)

小麥是世界上僅次于水稻的第二大糧食作物，種植范圍廣，總面積達2.2億hm2[1]，以面粉制品為主食的人口占世界人口的35%[2]。流行廣、危害重的銹病和白粉病是小麥生產(chǎn)中的主要病害，一旦發(fā)病，小麥產(chǎn)量嚴重降低，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。銹病分為條銹、葉銹和稈銹，分別由條形柄銹菌小麥?；?Pucciniastriiformisf. sp.tritici，Pst)、隱匿柄銹菌(Pucciniatriticina，Pt)和禾柄銹菌小麥?；?Pucciniagraminisf. sp.trtici，Pgt)引起；白粉病由禾本科布氏白粉菌小麥?；?Blumeriagraminisf. sp.tritici，Bgt)引起[3]。當前，選育抗病品種是防治小麥銹病和白粉病最經(jīng)濟、有效和安全的途徑[4]。小麥的抗病性主要分為垂直抗性和水平抗性兩類。垂直抗性又稱生理小種?；剐浴⑷诳剐缘?，由單基因控制，表現(xiàn)為從苗期至成株期均抗病，對病原菌侵染產(chǎn)生免疫或壞死反應(yīng)。但是在抗病品種的選擇壓力下，病原菌生理小種此消彼長，抗病品種的抗性會逐步喪失。因此近年來人們對水平抗性的研究和利用越來越多。水平抗性又稱部分抗性、非小種?；剐?、成株抗性等，由微效基因控制，苗期抗病性差，成株期則表現(xiàn)為慢病性，即病原菌侵入潛育期長、孢子堆小、產(chǎn)孢量低等。水平抗性對病原小種無?；?，抗性持久。已經(jīng)命名的成株抗性基因包括抗葉銹基因Lr12-13、Lr22a/Lr22b、Lr34-35、Lr37、Lr46、Lr48-49、Lr67-68[5]，抗條銹基因Yr11-Yr14、Yr16、Yr18、Yr29、Yr30、Yr36、Yr39、Yr46、Yr48、Yr49、Yr52、Yr54、Yr59、Yr62[6]，抗稈銹基因Sr2、Sr55、Sr56、Sr57、Sr58[6]以及抗白粉基因Pm38、Pm39、Pm46[7]。大田條件下，小麥病害往往相互疊加，僅對一種病害具有抗性往往不能有效控制病害對產(chǎn)量的影響。在已發(fā)現(xiàn)的小麥成株抗性基因中有4個基因同時對3種銹病和白粉病具有抗性，即Lr27/Yr30/Pm？/Sr2、Lr34/Yr18/Pm38/Sr57、Lr46/Yr29/Pm39/Sr58和Lr67/Yr46/Pm46/Sr55。多效抗病基因在國內(nèi)也被稱為一因多效基因、兼抗型成株抗性基因等。它們可以應(yīng)對生產(chǎn)上多病齊發(fā)的復(fù)雜大田環(huán)境，是珍貴的基因資源，如用于培育抗病品種事半功倍。

1 Lr27/Yr30/Pm？/Sr2基因研究進展

1916年，McFadden[8]以六倍體硬紅春小麥Marquis選系為父本，與稈銹和葉銹免疫的四倍體二粒小麥Yaroslav選系雜交，后經(jīng)稈銹病抗性、品質(zhì)和產(chǎn)量選擇培育出小麥品種Hope。在Hope的3B染色體短臂上有1個隱性成株抗性基因Sr2[9-10]，含有該基因的小麥大田成株期表現(xiàn)為慢病性(指小麥植株雖不能完全阻止病菌入侵，但可減緩病害發(fā)展速度的一種抗病性)，與擬黑穎病(pseudo-black chaff)緊密連鎖[11]，也與幼苗黃化基因sc連鎖[12]。2014年，Sr2基因被定位至Hope 3B染色體867 kb區(qū)間，包含34個基因，據(jù)此預(yù)測Sr2不屬于NB-LRR基因家族，且不同于已經(jīng)克隆的Lr34和Yr36[13]。從19世紀40年代以來，Sr2在小麥中得到了廣泛使用，為小麥生產(chǎn)提供了持久廣譜抗性，在澳大利亞和國際小麥玉米改良中心等的小麥品種中大量存在[10]。

1971年，Rajaram等[14]在澳大利亞品種Timgalen中發(fā)現(xiàn)了1個隱性抗葉銹病基因，將其暫時命名為LrT，后被證明該基因與澳大利亞品種Gatcher中的抗葉銹基因相同[15]。1980年，Mcintosh[16]將Timgalen、Gatcher和Hope 3B染色體上的抗葉銹基因正式命名為Lr27，該基因與Sr2緊密連鎖，與位于4BS的Lr31基因為互補基因，即2個基因同時存在時才表現(xiàn)抗性[15,17]。Singh等發(fā)現(xiàn)3BS上的抗葉銹基因位點對條銹病也有作用[18]，被命名為Yr30[19]。Mago等[17]研究發(fā)現(xiàn)之前被認為連鎖的Lr27和Sr2可能是同一個基因，該基因還具有白粉病抗性(相應(yīng)的白粉病抗性基因符號尚未確定，本文用Pm？表示)，Sr2或者說Pm？基因的白粉病抗性有待進一步研究。Lr27、Sr2、Pm？和Yr30為同一個基因的直接證據(jù)也需要在Sr2基因克隆之后才能給出。

在分子標記開發(fā)方面，Spielmeyer等[20]利用中國春和中國春Hope 3B代換系的F3群體構(gòu)建了3BS末端遺傳連鎖圖譜，發(fā)現(xiàn)SSR標記gwm533可以作為Sr2的連鎖標記用于分子標記輔助選擇。該標記在含有Sr2的品種中擴增出120 bp片段，在不含Sr2的品種中大部分擴增出155 bp片段或無擴增，個別擴增出假陽性120 bp片段。假陽性片段的SSR重復(fù)堿基構(gòu)成與陽性片段不同，可用STM標記stm559tgag和stm598tcac區(qū)分[21]。根據(jù)Hope 3B染色體BAC跨疊群開發(fā)的連鎖CAPS標記csSr2，對不含Sr2小麥材料的檢測符合率為100%，對含有Sr2小麥材料的檢測符合率為95%(共檢測122份材料，115份符合)[22]。Rasheed等[23]根據(jù)csSr2的SNP位點開發(fā)了KASP標記Sr2_ger9 3p，提高了檢測效率。2014年，Mago等[13]將Sr2定位至Hope3B的867 kb區(qū)域，候選基因包括10個類萌發(fā)素蛋白(Germin-Like Protein)，但在中國春的參考基因組序列中缺失。csSr2位于其中一個類萌發(fā)素蛋白上，是已報道距離Sr2最近的分子標記，該基因尚未被克隆。

2 Lr34/Yr18/Pm38/Sr57基因研究進展

Lr34基因源自普通小麥，最早發(fā)現(xiàn)于加拿大品種Terenzio并被命名為LrT2[24]，系譜追溯指向巴西品種Frontana，也有學(xué)者認為，中國春可能是其最初來源，位于7D染色體短臂。Lr34是成株抗性基因，成株期表現(xiàn)為慢病性，在苗期也有一定抗性，溫度低時(日均溫0～20 ℃)抗性更好[10]。對葉斑病(Sb1)[25]、稻瘟病[3]、大麥黃矮病(Bdv1)[26]均有抗性，與干葉尖性狀(Ltn1)共分離[27]。有報道顯示，Lr34與其他基因組合可以顯著提高抗性和持久性[28-29]。由于Lr34對多種病害具有持久廣譜抗性，在世界范圍被廣泛應(yīng)用。

1992年，Singh[30]和Mcintosh[31]分別報道了含有Lr34基因的品種或回交品系具有葉銹病成株抗性，該抗葉銹基因被命名為Yr18，遺傳分析顯示Lr34和Yr18緊密連鎖。2005年，Spielmeyer等[32]發(fā)現(xiàn)Lr34基因抗感分離的重組自交系群體在成株期白粉病抗性也分離，遺傳作圖顯示控制白粉病抗性的基因與Lr34和Yr18共分離，該基因被命名為Pm38[33]。2008年，Bansal等[34]檢測到穩(wěn)定的QSr.Sun-7DS與Lr34位點重合，表明Lr34與抗稈銹有關(guān)，2011年，Hiebertd等[35]在對加拿大小麥品種Peace的研究也證實Lr34對稈銹病具有抗性，隨后將此抗稈銹基因命名為Sr57[36]。

2009年，Krattinger等[37]克隆了Lr34基因，該基因編碼ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白，其作用機理屬于防御性反應(yīng)，通過產(chǎn)生類似衰老的葉片局部壞死而實現(xiàn)抗病?？共∨c感病基因間存在3個多態(tài)性位點，即第4內(nèi)含子的A/T顛換、第11外顯子的三堿基缺失和第12外顯子的C/T轉(zhuǎn)換[38]。隨后根據(jù)2個外顯子的堿基差異開發(fā)了功能標記cssfr1-cssfr6。在對功能標記驗證時發(fā)現(xiàn)，Jagger和H45屬于感病品種，但檢測結(jié)果為抗病基因型。序列分析發(fā)現(xiàn)，Jagger的Lr34基因外顯子22上發(fā)生了G/T轉(zhuǎn)換產(chǎn)生提前終止密碼子，缺失了C端的185個氨基酸導(dǎo)致基因功能喪失。據(jù)此開發(fā)了區(qū)分假陽性Jagger類型的CAPS標記cssfr7[39]。2010年，Dakouri等[40]通過圖位克隆方法再次確認了Lr34為ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白基因，開發(fā)了功能標記caIND11并發(fā)現(xiàn)了稀有變異類型。2016年，Rasheed等[23]開發(fā)了檢測三堿基缺失和Jagger類型G/T轉(zhuǎn)換的KASP標記Lr34_TCCIND和Lr34jagger，提高了檢測效率。

3 Lr46/Yr29/Pm39/Sr58基因研究進展

Lr46基因發(fā)現(xiàn)于國際小麥玉米改良中心(CIMMYT)小麥品種Pavon76，位于1B染色體長臂，部分顯性，屬于成株抗性基因，但抗性效應(yīng)小于Lr34?；蚨ㄎ话l(fā)現(xiàn)，Lr46的連鎖AFLP標記與1個抗條銹病基因也連鎖，將該抗條銹病基因命名為Yr29[41-42]。Lr46對葉斑病有抗性但效應(yīng)較小[25]，與干葉尖性狀(Ltn2)共分離[43]。2008年，Lillemo等[33]對CIMMYT小麥品種Saar進行抗白粉病基因定位時發(fā)現(xiàn)其含有Lr46/Yr29位點，并且該位點具有白粉病抗性，將其命名為Pm39。2013年，Singh等[44]報道Lr46/Yr29/Pm39/Ltn2可能還具有稈銹病成株抗性，該基因被命名為Sr58[45]。雖然Lr46與Lr34很類似，但是沒有證據(jù)表明它們所在的7DS和1BL發(fā)生過基因復(fù)制或染色體片段復(fù)制，兩者應(yīng)該是不同基因。

在分子標記開發(fā)方面，利用連鎖標記和小麥染色體缺失系Lr46被定位至1BL 0.84～0.89染色體區(qū)段，與水稻5L染色體有共線性關(guān)系。根據(jù)共線性區(qū)段的小麥EST開發(fā)分子標記，在Lalb×Lalb(PRL 1B)群體中篩選出XSTS1BL2和XSTS1BL17位于Lr46兩側(cè)各2.2 cM，XSTS1BL9與Lr46共分離[46]。Rosewarne等[43]在Lalb×Lalb.(Pavon 1B)和Lalb×Lalb.(Parula 1B)2個群體中發(fā)現(xiàn)STS標記BAC17R距Lr46位點2～3 cM。根據(jù)SNP位點開發(fā)的CAPS標記cslv46可以有效區(qū)分抗病鑒定含或者不含Yr29的近等基因系，是目前檢測Lr46最有效的分子標記[47-48]，該基因尚未被克隆。

4 Lr67/Yr46/Pm46/Sr55基因研究進展

1979年，Dyck和Samborski[49]在編號PI250413的巴基斯坦普通小麥中發(fā)現(xiàn)1個成株抗條銹基因，通過回交法將該成株抗條銹基因?qū)隩hatcher獲得品系RL6077。由于與Lr34抗病反應(yīng)相似，被推測是Lr34的染色體易位。細胞學(xué)研究否定了7D染色體發(fā)生過易位，關(guān)聯(lián)分析在2個用RL6077組配的分離群體中檢測到4DL上存在葉銹和條銹成株抗性位點，其中葉銹成株抗性基因被命名為Lr67[50]。2011年，Herrea-Foessel等[51]利用RL6077與感病親本Svocet S組配的群體進行了研究，驗證了Lr67并確定Lr67與Lr34是不同基因，將與其共分離的抗條銹基因命名為Yr46，同時發(fā)現(xiàn)Lr67/Yr46具有稈銹病抗性且與干葉尖性狀緊密連鎖，隨后他們又進一步研究了RL6077抗稈銹、白粉病和干葉尖性狀的關(guān)系，結(jié)果表明，Lr67/Yr46具有稈銹和白粉病抗性，并且與干葉尖連鎖，將其對應(yīng)基因分別命名為Sr55、Pm46和Ltn3[52]。

2015年，Kolmer等[47]克隆了Lr67基因，該基因編碼一個己糖轉(zhuǎn)運蛋白，其作用機理為營養(yǎng)限制，即通過抑制質(zhì)外體途徑的己糖轉(zhuǎn)運，使葉片中已糖比例升高，蔗糖比例下降，限制病菌對蔗糖的獲取，從而抑制病菌的生長?？共∨c感病基因編碼的己糖轉(zhuǎn)運蛋白僅存在2個氨基酸的差異，對葡萄糖攝取具有顯性負效應(yīng)。該基因的抗病性可能是通過改變葡萄糖轉(zhuǎn)運來減少葡萄糖攝取，從而減緩病菌生長。根據(jù)差異氨基酸位點的DNA序列設(shè)計了TM4和TM10兩個SNP功能標記，是用于分子標記輔助選擇育種的理想標記。

5 多效抗病基因的載體材料與利用情況

含有Sr2基因的原始材料為Hope和H44-24[8]，經(jīng)分子標記csSr2檢測含有該基因的材料還包括Sunstate、Opata、Pastor、Pavon76等[22]；Lr34基因存在于PI58548、中國春、川麥18、RL6058、Frontana、Glenlea、Opata等小麥材料中[38，53]；Lr46基因發(fā)現(xiàn)于CIMMYT材料Pavon76[41]，含有該基因的材料還包括Attila、Parula、Saar等[33-43]；Lr67基因來源于編號PI250413的巴基斯坦小麥[49]，后被導(dǎo)入RL6077[50]，Sujata和NP876也含有該基因[54]。

楊文雄等[55]2008年對中國的231份小麥育成品種(系)進行Lr34基因檢測，發(fā)現(xiàn)14份攜帶Lr34基因，占6.1%。Zeng等[56]2014年對330個品種和164個高代系進行檢測，發(fā)現(xiàn)2.0%的材料含有Yr18基因。Ren等[57]2015年對84份品種或高代系進行基因推導(dǎo)，認為13份材料含有Lr27基因，占檢測總數(shù)的15.5%。劉金棟等[58]2015年對成株抗性高代品系進行檢測，發(fā)現(xiàn)21份冬小麥中有3份含基因Sr2或Lr34或Lr46，沒有同時含2個以上基因的材料；96份春小麥中有9份同時含基因Lr34和Lr46，同時含基因Sr2和Lr46的有2份，同時含基因Sr2、Lr34和Lr46的僅1份。Moore等[54]2015年利用Lr67功能標記對115個中國地方品種進行檢測，發(fā)現(xiàn)僅3個品種含Lr67基因。劉理森等[23]2016年對241份小麥品種(系)進行檢測，發(fā)現(xiàn)59份材料含基因Pm38，占24.5%。張亞琦[59]2016年對460份常見小麥品種進行分析，發(fā)現(xiàn)59份品種含基因Lr34，占12.8%，89份品種含基因Lr46，占19.3%，11份品種同時含這2個基因，占2.4%。Rasheed等[23]2016年對223份中國大面積種植的小麥品種進行檢測，發(fā)現(xiàn)6份品種含基因Lr34，占2.7%；69份品種含基因Sr2，占30.9%；4份品種同時含這2個基因，占1.8%。以上研究說明，中國小麥育種材料含基因Lr34的最多，含Lr46或Sr2的次之，含Lr67的極少，同時含2個以上多效抗病基因的小麥品種仍較少。

中國小麥品種中多效抗病基因分布頻率較低，可能原因有3個：一是對多效抗病基因的重視不夠，一般僅作為成株抗病基因針對一種病害進行選擇，而忽略了其多效性；二是多效抗病基因單個基因的抗性表現(xiàn)不佳，中國小麥育種當前還是以常規(guī)育種為主，選育過程中追求高抗，多效抗病基因容易丟失；三是還未對多效抗病基因聚合后的效應(yīng)開展系統(tǒng)研究，不同基因數(shù)量和組合對小麥抗病性、農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的影響尚不明確，影響了育種利用。

6 研究展望

近年來，全生育期抗性品種因病原生理小種變化喪失抗性頻繁發(fā)生，CIMMYT對成株抗性的系統(tǒng)研究和育種實踐表明聚合4～5個微效成株抗性基因可以培育出持久抗性品種，有效減少產(chǎn)量損失。通過聚合Lr34、Lr46和Lr67等若干基因，獲得兼抗型持久抗性是CIMMYT小麥抗病育種的主要策略，美國、澳大利亞和歐洲也正在開展成株抗性研究或生產(chǎn)應(yīng)用[60]。CIMMYT和歐美對多效抗病基因利用的成功為中國小麥抗病育種指明了的方向。20世紀80年代以來，中國的育種家開始進行小麥成株抗性鑒定，相繼發(fā)現(xiàn)了豫麥2號、小偃6號、豫麥47、百農(nóng)64和魯麥21等大面積推廣的成株抗性品種[60]。與國外相比，當前中國的小麥成株抗性的研究和應(yīng)用尚處于起步階段。四川省農(nóng)科院與CIMMYT合作開展小麥育種始于2000年，2012年育成了96份成株抗性春小麥品系[58]。陽 霞等[61]將RL6077攜帶的多效抗病基因?qū)胛鬓r(nóng)979，分析了其與農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)性，獲得了抗病新種質(zhì)。中國農(nóng)科院作物所何中虎研究員多次在會議上強調(diào)多效抗病基因的重要性，并借鑒CIMMYT成熟的成株抗性育種方法，開展了抗條銹病和抗白粉病育種嘗試，提出了兼抗型成株抗性育種方法，為多效抗病基因的育種利用提供了參考。含有多效抗病基因的小麥種質(zhì)材料被引入中國多年，但聚合2個以上多效抗病基因的小麥品種并不多。對成株抗性的深入研究，特別是Lr34基因功能的深入研究，改變了育種家對多效抗病基因的認識，功能分子標記的開發(fā)為分子標記輔助選擇育種掃清了障礙。在中國小麥品種(品系)中已發(fā)現(xiàn)基因Sr2、Lr34和Lr46，應(yīng)通過分子標記對其進行選擇，并與其他抗病基因組合利用?；騆r67在中國利用較少，與受體親本Thatcher相比，含有Lr67的回交品系RL6077葉銹抗性明顯改善，且產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀均無明顯差異，表明其對產(chǎn)量和品質(zhì)性狀沒有負效應(yīng)，在育種上的應(yīng)用值得期待，應(yīng)加強該基因在中國小麥育種中的利用。有效利用已有的多效抗病基因，鑒定和克隆新基因，將會為中國選育兼抗型持久抗性小麥品種奠定堅實基礎(chǔ)。