非小細胞肺癌EGFR突變非侵入性檢測技術研究進展

袁世洋 鄒葉青 謝軍平

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）的突變是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的重要驅(qū)動因素，導致EGFR靶向治療成為NSCLC的治療選擇[1]。雖然EGFR靶向治療耐藥的發(fā)生仍然不可避免，但發(fā)現(xiàn)其中約有60%是因EGFRT790M突變引起，這類患者可進一步獲益于第三代TKI藥物[2,3]。因此，治療前了解患者EGFR突變狀態(tài)，治療過程中持續(xù)監(jiān)測耐藥基因突變情況，對NSCLC患者靶向藥物的管理有著重要的意義。為實時監(jiān)測突變患者用藥過程中耐藥基因的突變情況，反復進行有創(chuàng)的方式采集組織樣本，似乎不可取。而用于腫瘤取樣的非侵入性方法以實時監(jiān)測耐藥性突變無疑是最佳的選擇。近年來“液體活檢”技術已得到快速的發(fā)展，除血液[4]、胸水[5]樣本外，支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage, BAL）[6]、呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate, EBC）[7]以及尿液[8]等也可用于EGFR突變的檢測，并且同樣顯示了良好的靈敏度和特異度。在此，我們對上述幾種液體樣本材料的“液體活檢”在檢測NSCLCEGFR突變的現(xiàn)況和前景作一綜述。

1 “液體活檢”的生物學基礎

癌細胞的快速更新導致腫瘤衍生的核酸和囊泡不斷地釋放至血液系統(tǒng)中。并且活的腫瘤細胞也可以從原發(fā)灶中脫落至血流中，這類細胞稱之為循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumour cells, CTCs）。血液系統(tǒng)中可以包含來自于腫瘤組織和其他組織分泌或脫落的細胞、囊泡（如外泌體）、細胞游離DNA（cell-free DNA, cfDNA）和RNA（cfRNA）以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)?！耙后w活檢”就是檢測血液中的具有原發(fā)腫瘤組織遺傳信息的循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumour DNA, ctDNA）、腫瘤衍生的RNA（主要為microRNA）、外泌體以及CTCs等。與侵入性檢測方法相比，臨床醫(yī)生通過“液體活檢”這一非侵入性檢測方法實時的了解患者體內(nèi)癌癥的進展情況顯得更為便捷[9]。

2 “液體活檢”的多種檢測平臺的比較

“液體活檢”標本的分析是具有挑戰(zhàn)性的，因為循環(huán)cfDNA主要由正常細胞的DNA和癌癥患者中存在的相對小且高度可變的ctDNA部分組成。而傳統(tǒng)DNA分析方法（如Sanger測序）的靈敏度不足以檢測癌癥患者血漿ctDNA中的體細胞突變。因此，開發(fā)更靈敏的測序分析在NSCLC的治療中尤為重要。目前，已有多種半定量和定量基因分析平臺用于血漿基因分型，以下將簡單介紹這些檢測平臺之間的差異。

基于PCR的多種半定量基因檢測平臺包括擴增難治性突變系統(tǒng)（amplified refractory mutation system,ARMS）[10]、Cobas[4]和肽核酸（peptide nucleic acid, PNA）鉗[11]等可達0.1%的檢測下限，并且在多項研究中顯示具有較高的特異性和適度的敏感性。數(shù)字PCR（digital polymerase chain reaction, dPCR）作為DNA定量的新技術，實現(xiàn)了單分子DNA絕對定量。微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）[12]和磁珠乳液擴增（Bead, Emulsion,Amplification, Magnetic, BEAMing）[13]技術是基于dPCR技術的新的基因突變檢測平臺，檢測更為精細，下限分別可達0.001%和0.01%。利用這些高靈敏度平臺進行的血漿基因分型檢測已被證明可快速檢測和定量轉(zhuǎn)移性NSCLC患者血漿中存在的突變型cfDNA水平，具有高度特異性。上述這些檢測平臺主要優(yōu)勢在于快速、高靈敏度、不需生物信息學分析以及具有成本效應，便于臨床推廣。而不足之處在于：只能監(jiān)測已知的突變。

此外，非靶向全基因組分析能夠在不事先知道腫瘤中可能存在的畸變的情況下鑒定腫瘤特異性改變。因此，可以利用這些方法從源頭發(fā)現(xiàn)治療耐藥的基因變化，并鑒定癌癥患者中新的可操作靶標。下一代測序（next-generation gene sequencing, NGS）是一種技術，涉及將DNA片段固定在固體載體上并讀取序列作為DNA合成過程的一部分。使用NGS，可以在單個反應中產(chǎn)生數(shù)百萬個ctDNA序列，隨后進行比對并與參考基因組或從同一患者（非惡性組織，通常是外周血單核細胞）獲得的種系DNA進行比較，使得可以鑒定相對于參考序列的核苷酸變化[14]?，F(xiàn)在已經(jīng)設計了幾種基于NGS的方法，不僅能夠檢測點突變和插入、缺失或重排，還能夠檢測拷貝數(shù)改變和基因融合[15]。NGS的優(yōu)勢在于探索治療抗性新的突變機制，主要推廣難點在于檢測周期長，需要生物信息學分析，并且檢測昂貴。

3 “液體活檢”在NSCLC患者EGFR突變檢測中的臨床應用

3.1 基于血液的“液體活檢” 對患者血液中ctDNA進行分子檢測是目前應用最為廣泛和成熟的“液體活檢”。Sacher等[16]的前瞻驗證性研究納入120例新診斷和60例初代EGFR-TKI耐藥的非鱗癌NSCLC患者，采用ddPCR法檢測所有患者的血漿cfDNA的EGFR19-del、L858R以及T790M突變狀態(tài)，并把患者組織基因型作為參考標準，比較其檢測的敏感度和特異度。研究結果顯示，所檢測EGFR 3個位點的敏感度大致相似，約70%-80%，但隨患者腫瘤轉(zhuǎn)移部位的增多、合并肝或骨轉(zhuǎn)移而提高，認為血漿EGFR突變的檢測敏感性疾病負荷以及肝或骨轉(zhuǎn)移相關，這可能提示腫瘤的ctDNA增加；檢測19-del、L858R的特異度高達100%（95%CI: 97%-100%）；檢測T790M特異度相對較低，僅有63%，即有8例血漿中檢測出T790M陽性，匹配的組織基因型為T790M陰性，但接受第三代EGFR-TKI治療有效，被認為這是由腫瘤組織存在的異質(zhì)性引起?；谄渌脚_如BEAMing[17]、Cobas[4]、NGS[18]等檢測血液cfDNA也顯示出相似的結果：檢測血漿EGFR敏感突變具有顯著的特異性，可用于篩選陽性人群而避免再次侵入性活檢；同時也可檢測出因腫瘤異質(zhì)性在組織基因分型中遺漏的T790M陽性突變患者；但敏感度相對欠佳，存在較大的假陰性（30%）可能，尚需要腫瘤組織活檢。

CTCs可以從癌癥患者的血液中分離，其研究前景廣泛，不僅可以充當作為癌癥預后以及判斷治療療效的生物標志物，也可以用分離的CTCs進行分子檢測明確原發(fā)腫瘤的遺傳特性指導和檢測靶向藥物療效，未來更可以通過建立CTC衍生的異種移植物（CTC derived xenografts, CDXs）模型探討多耐藥的癌癥細胞接受新藥物的治療效果[19-21]。然而，血液中的CTCs豐度較低，每毫升血液存在有限個數(shù)的CTCs，對開發(fā)進一步的臨床應用尚需要更有效的富集技術及更高精度的分子檢測方法[22]。近年來，CTCs有效的富集技術已得到較大的發(fā)展，有數(shù)篇綜述對此進行了全面而系統(tǒng)的評價[23,24]，此處我們著重探討利用CTCs進行分子檢測的可行性。Gao等[25]通過建立組合免疫磁珠（EpCAM, MUC1, EGFR）富集肺癌細胞，采用ddPCR芯片技術檢測CTCs的EGFRL858R突變狀態(tài)。結果顯示，富集有效率高達90%以上；在L858R突變的H1975細胞中有檢測到EGFRL858R突變和EGFR野生型突變，在沒有L858R突變的A549細胞中僅檢測到EGFR野生型突變；在已知的2例EGFRL858R突變的患者中檢測到結果與組織基因突變型一致，而在已知沒有EGFR突變的1例肺癌患者以及2名健康人中檢測到EGFR野生型突變。因此，作者認為采用ddPCR芯片技術檢測CTCs的EGFR突變狀態(tài)用于指導臨床用藥是具有可行性的，但仍需要更大樣本量臨床研究驗證。

外泌體在細胞間交換分子信息方面具有重要作用，它們已被證明含有蛋白質(zhì)以及一系列核酸，包括DNA、mRNA和miRNA等[26]。因此，腫瘤細胞分泌的外泌體可攜帶其本身的遺傳信息，檢測腫瘤患者體液的外泌體DNA或RNA可用于反映腫瘤組織的遺傳特性。Krug等[27]從參加TIGER-X（NCT01526928）臨床研究的患者篩選出84例患者，收集患者相匹配的腫瘤組織及血液樣本，分離提取血液中的外泌體的DNA和RNA（合稱exoNA）以及血液中的ctDNA，比較EXO1000 NGS平臺檢測exoNA與EBMAing平臺檢測ctDNAEGFR突變狀態(tài)的敏感度和特異度。結果顯示，與腫瘤組織EGFR突變型作為參考標準，exoNA檢測患者EGFR敏感突變型和T790M突變的敏感度均高于ctDNA，差異有統(tǒng)計學意義（分別為P=0.004和P=0.003），突變拷貝數(shù)和突變等位基因分數(shù)（mutant allele fraction,MAF）exoNA顯著高于ctDNA可能是這一差異的原因之一。在循環(huán)中核酸水平低的情況下，例如腫瘤負荷低，胸內(nèi)疾病或早期發(fā)現(xiàn)癌癥的患者，基于exoNA的液體活檢平臺可能特別有益。Castellanos-Rizaldos等[28]的研究也顯示了相似的結果，其設計敏感等位基因特異性qPCR來檢測分離提取的exoNAEGFRT790M突變狀態(tài)。結果顯示，使用腫瘤活檢結果作為參考標準時，檢測exoNA上的T790M突變達到了92%的靈敏度和89%的特異度。對胸內(nèi)疾病（M0/M1a）患者獲得了較高靈敏度（88%），因此認為對于這些患者，基于exoNA的液體活檢檢測更有優(yōu)勢?？傊鄬tDNA，exoNA顯示出更高的突變拷貝數(shù)和突變等位基因分數(shù)，這使得基于exoNA的液體活檢可獲得更高的靈敏度。

3.2 基于胸腔積液的“液體活檢” 目前臨床上針對胸腔積液的檢測，僅限于常規(guī)、生化以及胸水細胞學和染色體等，診斷水平停留在“找見腫瘤細胞”或“未找見腫瘤細胞”。而早在2006年，Cavalli等[29]認為在胸腔積液中體細胞EGFR突變的研究是切實可行的，在許多NSCLC患者中，胸腔積液采樣被視為腫瘤細胞采集的更具侵入性方法的替代方案。該研究共納入了68例一線化療失敗的合并有惡性胸腔積液的NSCLC患者。檢測所有患者胸腔積液細胞組織蠟塊DNA的EGFR19-Del和L858R突變狀態(tài)，41例陽性患者采用吉非替尼治療（實驗組），27例陰性患者采用鉑類為基礎的二線化療（對照組）。結果顯示，實驗組的無進展生存期（progression-free survival, PFS ）、客觀反應率（objective response rate, ORR）、疾病控制率（disease control rate, DCR）均優(yōu)于對照組。認為在晚期非小細胞肺癌合并惡性胸腔積液患者中檢測EGFR突變是可行的且檢出率高［60.3%（41/68）］，靶向治療是這些突變患者安全有效的方法。Yeo等[30]的研究納入了37例患有惡性胸腔積液的NSCLC患者，通過PNA鉗和直接測序法檢測患者腫瘤組織、胸腔積液和血清的EGFR突變狀態(tài)。結果顯示，與腫瘤組織相比，胸腔積液EGFR突變檢測敏感性為89%、特異性為100%。他們認為，和血液樣本相比，胸腔積液的檢測效能和腫瘤組織相當，能夠更敏感、更準確地檢測EGFR突變狀態(tài)。

3.3 基于支氣管肺泡灌洗液的“液體活檢” 隨著呼吸內(nèi)鏡技術的快速發(fā)展，支氣管沖洗、刷洗或支氣管肺泡灌洗技術已成為常規(guī)呼吸內(nèi)鏡技術，獲得的BAL（在此我們把支氣管沖洗液或刷洗液也稱之為BAL）通?？捎糜诩膊〉脑\斷。Kawahara等[31]為探索在BAL樣本上清cfDNA中檢測EGFR突變的可行性，研究共納入74例含有BAL樣本的肺腺癌患者，已知的腫瘤組織病理標本EGFR突變狀態(tài)作為參考標準，采用PCR技術分析BAL樣本上清cfDNAEGFR突變的敏感度為88.0%，特異度為100%。Park等[32]也做了類似的研究，通過PNA鉗技術檢測BAL樣本分離的cfDNAEGFR突變狀態(tài)，結果顯示BAL上清的cfDNA與腫瘤組織檢測出EGFR突變的結果一致率高達91.7%，具有較高的診斷價值，也證實了在BAL樣本檢測EGFR突變的可行性。目前這一結論尚缺乏大樣本、多中心的臨床研究驗證，而臨床支氣管內(nèi)鏡診斷肺癌的發(fā)展方向是如何更加精準地獲取腫瘤組織標本，如支氣管超聲引導的針吸活檢術（endobronchial ultrasound-transbronchial needle aspiration,EBUS-TBNA）[33]。

3.4 基于呼出氣冷凝液的“液體活檢” 呼出氣體冷凝液（exhaled breath condensate, EBC）是呼出氣體的液體形式。它是一種非侵入性器官特異性無細胞生物液，來自氣道襯里液，已知是肺癌特異性DNA的來源。十年前，Paradiso等[34]在23例NSCLC患者中檢測到1例EGFR19-DEL突變，并且在EBC和腫瘤組織中檢測到的基因型不一致。因此認為，在EBC中檢測體細胞EGFR基因突變狀態(tài)是不可行的。而Zhang等[35]在重度吸煙的肺鱗癌患者的EBC中檢測到EGFR 19-Del，隨后通過纖支鏡獲取標本組織并EGFR檢測提示確實存在19-Del突變，并在使用吉非替尼治療后顯示出良好的療效。他們認為能檢測到EGFR突變可能歸因于PCR方法的敏感性或腫瘤位置。最近，Smyth等[36]的研究中共納入了19例具有EGFR陽性突變的晚期NSCLC患者，其中10例為T790M突變，9例為EGFR敏感突變。收集患者相應靶向治療前匹配的血液和EBC樣本，用于檢測T790M突變。結果顯示，在10例T790M陽性患者的EBC標本中檢測出9例T790M陽性，而血液標本檢出7例；在9例EGFR敏感突變患者的EBC和血液標本均為檢測T790M陰性突變。其原因可能是，EBC樣本比血液樣本含有更低水平的野生型DNA及內(nèi)源性核酸酶活性，因此更適用于肺部疾病的檢測。但研究樣本量較少，不足以進行統(tǒng)計分析，需要進一步研究驗證EBC作為EGFR突變肺癌患者血漿中檢測EGFR-T790M的替代或輔助的作用。

3.5 基于尿液的“液體活檢” 由于cfDNA或ctDNA片段小、分子量低，可以經(jīng)腎過濾后從尿液排出。因此，尿液可能是研究ctDNA的有價值的來源[37]。研究[38,39]表明，在血漿ctDNA中檢測到的腫瘤特異性遺傳改變（如點突變和甲基化譜等），也可以在匹配的尿ctDNA中檢測。Reckamp等[40]的研究共納入63例患者，采用突變富集PCR聯(lián)合NGS檢測尿液和血液ctDNAEGFR19-Del、L858R和T790M突變狀況。結果顯示：使用腫瘤組織檢測結果作為參考標準，尿液中（所有樣本，尿量為10 mL-100 mL）[38,39]突變檢測的敏感性：T790M為72%，L858R為75%，19-Del為67%。而對于推薦尿量為90 mL-100 mL的樣本，EGFR突變檢測靈敏度：T790M為93%，L858R為80%，19-Del為83%。使用從健康供體和非NSCLC轉(zhuǎn)移性癌癥人群獲得的尿樣測定EGFR尿液測定的特異性：T790M為96%，L858R為100%，19-Del為94%。檢測血漿的靈敏度：T790M為93%，L858R為100%，19-Del為87%。使用從健康供體和患有非NSCLC轉(zhuǎn)移性癌癥的人群獲得的血漿樣品確定EGFR血漿測試的特異度：T790M為94%，L858R為100%，19-Del為96%。值得注意的是，尿液和血漿測試共同確定了另外12例T790M陽性病例，這些病理組織標本檢測為T790M陰性，接受rociletinib治療期間監(jiān)測到有9例患者在第21天觀察到尿T790M水平的快速降低。因此認為尿液可以作為EGFR檢測的非侵入性來源樣本，和血液標本相比，具有類似的高靈敏度和特異度。Chen等[8]招募了150例EGFR敏感突變并接受EGFRTKIs的NSCLC患者參與系列的檢測研究，在TKI治療開始前，使用ddPCR法對患者原發(fā)腫瘤組織樣本、血液和尿液樣本進行EGFR突變檢測，隨后每間隔1個月采集患者血液和尿液標本用于EGFR突變檢測，共持續(xù)9個月。結果顯示，治療前尿ctDNAEGFR突變檢出結果與腫瘤組織結果一致率達88%，且?guī)缀鹾脱簶吮緳z出結果一致。采用尿液監(jiān)測期間，53%的患者出現(xiàn)T790M突變，這些患者在血漿ctDNA中也得到證實。認為，尿液cfDNA可能是常規(guī)基于原發(fā)組織的EGFR突變檢測的潛在替代方案。尿液EGFR突變檢測靈敏度與血漿結果相當，具有用于監(jiān)測EGFR-TKI治療的臨床效用。目前，定量檢測尿液ctDNAEGFR突變狀態(tài)仍然是具有挑戰(zhàn)性的，主要因存在的ctDNA豐度低。另外，尿液ctDNA含量也可能受到患者臨床狀態(tài)的影響[41]。未來隨著DNA擴增和測序技術的進一步發(fā)展，相信尿液活檢作為真正意義上的非侵入性替代方案會得到更大的發(fā)展。

4 總結與展望

搭載不同檢測平臺的多種液體樣本的“液體活檢”作為非侵入性技術實時監(jiān)測EGFR突變已顯示其優(yōu)越性和臨床應用前景?；谛厍环e液的“液體活檢”應當是目前首選檢測EGFR突變的組織替代方案，不僅在于其所含ctDNA豐度高，而且可提供腫瘤的細胞學材料。血液樣本是目前應用最為廣泛的“液體活檢”材料，其臨床價值顯著，但血液循環(huán)中極低豐度的ctDNA，對檢測技術帶來了挑戰(zhàn)，最直觀的體現(xiàn)在于靈敏度不高。尿液樣本中ctDNA和血液樣本同源且片段更為細小，ctDNA的含量容易受患者臨床狀況所影響，給檢測帶來相當?shù)碾y度，但可通過增加尿液量收集ctDNA達到和血液標本幾乎一致的檢測效能，且尿液是真正意義上的非侵入性材料，值得進一步開發(fā)利用。我們認為，檢測外泌體DNA或RNA是最值得開發(fā)的項目，因為exoDA中的突變拷貝數(shù)和MAF分數(shù)比ctDNA更高，體現(xiàn)出的檢測效能也更高，不足的是操作步驟較復雜且需要搭載靈敏度更高的檢測平臺。目前這些材料體現(xiàn)出檢測NSCLCEGFR突變臨床應用的潛能，除血液和胸腔積液，其他液體材料仍缺乏相應的臨床研究結果證實，相信未來將會被一一證實，尤其是應用尿液外泌體檢測腫瘤的分子狀態(tài)。