長(zhǎng)鏈非編碼RNA在非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKIs耐藥中的研究進(jìn)展

李樹(shù)斌 于鴻 張耿月

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因[1]。近年來(lái)，雖然在臨床和實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)方面取得了可喜的進(jìn)展，但肺癌患者的預(yù)后仍不理想，5年總生存率僅在15%左右。這主要由于很大一部分患者在被確診時(shí)已經(jīng)處于癌癥晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)期。

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占所有肺癌病例的85%，包括兩個(gè)主要的組織學(xué)亞型：腺癌（lung adenocarcinoma, LAD）和鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）。2004年在NSCLC患者中首次發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變。雖然大約有10%的患者表現(xiàn)出原發(fā)性耐藥，但是大多數(shù)攜帶EGFR突變的患者對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFRTKIs）如厄洛替尼（erlotinib）和吉非替尼（gefitinib）治療敏感。EGFR-TKIs的應(yīng)用極大的提高了NSCLC患者的臨床療效，然而那些對(duì)治療敏感的患者在治療10個(gè)月-16個(gè)月后會(huì)不可避免的獲得抗藥性，導(dǎo)致癌癥進(jìn)展。

一些EGFR-TKIs耐藥的機(jī)制已經(jīng)被闡明，如c-MET擴(kuò)增、PIK3CA突變、EGFR“gatekeeper”突變（T790M）、BRAF突變、NF-κB活化和小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化等，但是仍有大約30%的病例其EGFR-TKIs耐藥的機(jī)制是不清楚的。最近，高通量基因組分析顯示，在人類腫瘤組織樣本和腫瘤細(xì)胞系中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）對(duì)于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展都具有突出的重要作用。越來(lái)越多的研究證據(jù)也表明lncRNAs參與NSCLC的發(fā)生和進(jìn)展。因此，深入研究lncRNAs的功能為闡明NSCLC的生物學(xué)機(jī)制開(kāi)辟了新的途徑，也為開(kāi)發(fā)更有效的治療手段提供了新的可能性。目前雖然已有報(bào)道lncRNAs，如HOTAIR[2]、MEG3[3]、CCAT1[4]等在NSCLC化療耐藥中發(fā)揮作用。但是NSCLC EGFR-TKIs耐藥中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)模式和潛在的功能仍然是未知的。本文總結(jié)了lncRNAs在NSCLC EGFR-TKIs耐藥中的研究進(jìn)展。

1 LncRNAs的胞內(nèi)定位和作用機(jī)制

LncRNAs的長(zhǎng)度大于200 nt（nucleotides），缺乏或沒(méi)有蛋白編碼能力，可參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括X染色質(zhì)印跡、細(xì)胞分化、選擇性剪接、細(xì)胞命運(yùn)決定、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等[5]。目前已經(jīng)被鑒定的lncRNAs超過(guò)30,000條。但是僅有1%的lncRNAs的功能被研究。

LncRNAs的功能是由其在細(xì)胞內(nèi)的定位決定的。多數(shù)核內(nèi)lncRNAs指導(dǎo)染色質(zhì)修飾，它們通過(guò)招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3和組蛋白修飾基因，如polycomb repressive complex PRC2和histone H3 lysine 9（H3K9）甲基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。此外，lncRNAs的自身轉(zhuǎn)錄也可以負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。根據(jù)距離其作用位點(diǎn)的遠(yuǎn)近，核內(nèi)lncRNAs的作用方式可分為cis-和trans-acting兩種。cis-acting lncRNAs主要調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近的基因表達(dá)，而trans-acting lncRNAs調(diào)節(jié)遠(yuǎn)處獨(dú)立位點(diǎn)的基因表達(dá)。目前這兩種lncRNAs的作用機(jī)制都尚未完全被闡明。一些可能的機(jī)制包括招募橋蛋白，形成RNA-DNA三聯(lián)體，通過(guò)RNA結(jié)構(gòu)識(shí)別DNA。核內(nèi)的lncRNAs對(duì)基因位點(diǎn)也有直接的調(diào)節(jié)作用，它們可以作為誘餌隔離轉(zhuǎn)錄因子、變構(gòu)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)蛋白、改變核域和染色體的三維結(jié)構(gòu)[6]。

胞質(zhì)中l(wèi)ncRNAs調(diào)節(jié)翻譯過(guò)程和mRNA的穩(wěn)定性[6]。它們通過(guò)堿基配對(duì)對(duì)翻譯過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。它們的另一個(gè)特別的功能是作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNAs（competing endogenous RNAs, ceRNAs）結(jié)合并阻斷特異性的miRNAs，作為“miRNA sponges”保護(hù)靶mRNAs不被抑制。這一功能與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞分化、多能性等很多生物學(xué)過(guò)程有關(guān)。此外，細(xì)胞質(zhì)中一些含有小的開(kāi)放閱讀框（open reading frames, ORFs）的lncRNAs是能夠被翻譯成有生物學(xué)活性的小肽的。

由于lncRNAs的非保守性，它們可在不同水平通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在轉(zhuǎn)錄水平，lncRNAs一方面可以抑制轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的結(jié)合，通過(guò)與RNA PII的相互作用調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。另一方面lncRNAs也可作為ceRNA調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。此外，lncRNAs還有轉(zhuǎn)錄因子共激活子的功能，可以與DNA形成三螺旋結(jié)構(gòu)影響靶基因的轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄后水平，lncRNAs調(diào)節(jié)pre-mRNAs的選擇性剪接，通過(guò)與miRNAs相互作用影響mRNA的翻譯。lncRNAs可與mRNA形成雙鏈RNA，提高mRNA的穩(wěn)定性，也可被切割成小的非編碼RNA行使mRNA調(diào)節(jié)功能。在表觀遺傳調(diào)控水平，lncRNAs控制DNA甲基化（影響啟動(dòng)子CpG島甲基化），調(diào)節(jié)組蛋白修飾（甲基化、乙?；头核鼗ncRNAs還可與染色質(zhì)修飾復(fù)合物結(jié)合調(diào)控染色質(zhì)重塑、基因表達(dá)和腫瘤發(fā)生等[7]。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，lncRNAs既能發(fā)揮促進(jìn)作用也能產(chǎn)生抑制作用。在p53、NF-κB、PI3K/AKT等一些腫瘤相關(guān)的重要信號(hào)通路中，lncRNAs可作為信號(hào)級(jí)聯(lián)中的受體、蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等的連接支架，將多種信號(hào)分子連接起來(lái)進(jìn)而調(diào)控信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程。p53信號(hào)的下游事件中有大量的lncRNAs參與，一些lnRNAs能夠自反饋調(diào)節(jié)p53表達(dá)和穩(wěn)定性，例如p53在應(yīng)答DNA損傷時(shí)誘導(dǎo)Linc-RoR表達(dá)。Linc-RoR啟動(dòng)子中又含有一些保守的p53結(jié)合位點(diǎn)可與p53相互作用阻斷p53的翻譯。NF-κB信號(hào)通路失常與炎癥、耐藥、腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。NF-κB-互作lncRNA（NF-κB-interacting lncRNA, NKILA）在NF-κB信號(hào)通路中起支架作用。NF-κB上調(diào)NKILA表達(dá)。NKILA又與NF-κB復(fù)合物相互作用，阻止IKK引發(fā)的IκB磷酸化，抑制NF-κB活化。在PI3K/AKT信號(hào)通路中，lncRNAs同樣通過(guò)靶向信號(hào)通路的不同成分發(fā)揮獨(dú)特的作用。值得注意的是，NF-κB是AKT的效應(yīng)器。因此，AKT相關(guān)的lncRNAs在某種程度上也會(huì)影響NF-κB的活性[8]。

2 LncRNAs與NSCLC

與基因一致，lncRNAs也可分為原癌lncRNAs和腫瘤抑制lncRNAs。在NSCLC中前者包括MALAT1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1）[9]、CCAT2（colon cancer-associated transcript 2）、HOTAIR（HOX transcript antisense intergenic RNA）、IGFBP4-1（insulin-like growth factor binding protein 4-1）[10]、TFPI2AS1（TFPI2的antisense transcript）[11]、LINC00152[12]、BLACAT1（bladder cancer associated transcript 1）[13]、LINC00968[14]、FAM83H-AS1（FAM83H antisense RNA1）[15]等。后者有AK126698、MEG3（maternally expressed gene 3）、GAS6-AS1（growth-arrest-specific gene 6 antisense 1 RNA）、BANCR（BRAF activated non-coding RNA）、RP11-713B9.1（TSLC1的antisense transcript）[16]、GAS5（growth arrestspeci fic transcript 5）[17,18]等。

2.1 原癌lncRNAs與NSCLC CCAT2在NSCLC尤其是LAD中高表達(dá)[19]，推測(cè)CCAT2通過(guò)TCF7L2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄上調(diào)MYC、miR-17-5p、miR-20a表達(dá)，增強(qiáng)Wnt信號(hào)活性，促進(jìn)細(xì)胞遷移。HOTAIR通過(guò)招募PRC2（polycomb repressive complex 2）或重組染色質(zhì)促進(jìn)多種腫瘤進(jìn)展。初步的研究[2]已經(jīng)證明HOTAIR通過(guò)影響p21表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和G0期/G1期阻滯，介導(dǎo)NSCLC患者對(duì)順鉑耐藥。linc00673在NSCLC組織中表達(dá)上調(diào)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期正相關(guān)[20]。其作用機(jī)制可能是linc00673通過(guò)與miR-150-5p相互作用間接作用于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition, EMT）關(guān)鍵基因ZEB1促進(jìn)NSCLC進(jìn)展[21]。lncRNA NEAT1（nuclear enriched abundant transcript 1）在NSCLC組織樣本中表達(dá)顯著上調(diào)并與患者的不良預(yù)后正相關(guān)[22,23]。有報(bào)道m(xù)iR-377-3p（MIMAT0000730）與NEAT1相互作用。與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)有關(guān)的E2F3（E2F transcription factor 3）攜帶2個(gè)保守的miR-377-3p同源位點(diǎn)，可能是miR-377-3p的靶基因[24]。NEAT1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-377-3p/E2F3軸在NSCLC進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。此外，Li等的研究表明，lncRNA-NEAT1與miR-181a-5p相互作用，miR-181a-5p的靶基因是HMGB2。在NSCLC中l(wèi)ncRNANEAT1與miR-181a-5p競(jìng)爭(zhēng)性作用于HMGB2[25]。Wu等[26]發(fā)現(xiàn)lncRNA-NEAT1與hsa-mir-98-5p相互作用，而hsa-mir-98-5p的靶基因是MAPK6。他們證明NEAT1/has-mir-98-5p/MAPK6在NSCLC進(jìn)展中同樣發(fā)揮重要作用。對(duì)lncRNANEAT1的研究充分說(shuō)明了lncRNAs的作用機(jī)制的復(fù)雜性，未來(lái)有太多的問(wèn)題需要深入探討。

2.2 腫瘤抑制lncRNAs與NSCLC AK126698的表達(dá)水平在NSCLC組織中顯著降低，并且與腫瘤大小和病理分期相關(guān)[27]。Axin1、β-catenin、c-myc和cyclin D1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要組成部分。過(guò)表達(dá)的AK126698使FZD8（Frizzled-8，一個(gè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的受體）和β-catenin表達(dá)下調(diào)，Axin1和E-cadherin表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)NSCLC患者對(duì)順鉑治療的敏感性[28]。MEG3在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。在NSCLC中MEG3低表達(dá)的患者總生存時(shí)間減少[29]，可能是由于MEG3低表達(dá)導(dǎo)致p53表達(dá)降低造成的。GAS6-AS1表達(dá)降低有助于NSCLC進(jìn)展[30]，可作為NSCLC的預(yù)后標(biāo)志。其機(jī)制可能涉及到GAS6基因。GAS6是Axl/Sky的一個(gè)配體。GAS6/Axl是多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移所必需的。BANCR在NSCLC患者腫瘤組織中表達(dá)降低并與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和患者的總生存時(shí)間減少有關(guān)[31]，其機(jī)制可能涉及EMT。NSCLC腫瘤組織中l(wèi)ncRNA-TUG1（taurine-upregulated gene 1）表達(dá)顯著降低并且與患者的性別、吸煙史、腫瘤分化程度相關(guān)[32]。CELF1（CUGBP and Elav-like family member 1）是受TUG1負(fù)調(diào)節(jié)的靶基因。TUG1 RNA通過(guò)結(jié)合CELF1啟動(dòng)子區(qū)的PRC2負(fù)調(diào)節(jié)CELF1表達(dá)在NSCLC進(jìn)展中發(fā)揮作用。

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果 2016年，Zequn等[33]分析了人類大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的lncRNA和mRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)二者之間有313個(gè)LncRNAs和252個(gè)mRNAs差異表達(dá)。其中LncRNA TATDN1（Homo sapiens TatDDNase domain containing 1）可能通過(guò)Wnt/β-catenin和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路靶向β-catenin和Ezrin在腫瘤發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。Xu等[34]檢測(cè)分析了肺腺癌組織的lncRNA和mRNA表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的lncRNAs共有2,420條。作者最終確認(rèn)了2個(gè)差異表達(dá)最顯著的lncRNAs，分別是高表達(dá)的LOC100132354和低表達(dá)的RPLP0P2。很顯然，針對(duì)這兩個(gè)lncRNAs的深入研究將有助于闡明肺腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。Zhang等[35]也檢測(cè)分析了肺腺癌組織的LncRNA表達(dá)譜并從中選擇了差異表達(dá)最顯著的LncRNA ZXF1深入研究。結(jié)果表明，肺癌組織的LncRNA ZXF1表達(dá)水平顯著升高，并且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、不良預(yù)后相關(guān)。

3 LncRNAs與NSCLC EGFR-TKIs耐藥

LncRNAs在靶向藥物耐藥中的作用在一些腫瘤的研究中已有報(bào)道。如腎癌的Sunitinib耐藥[36]、肝癌的sorafenib耐藥[37]。本文主要關(guān)注在lncRNAs在NSCLC EGFR-TKIs耐藥中的研究進(jìn)展。

3.1 利用生物信息學(xué)方法分析lncRNAs與NSCLC EGFRTKIs耐藥的關(guān)系 隨著生物信息學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，很多研究人員開(kāi)始使用公共數(shù)據(jù)集來(lái)分析人類疾病的lncRNA表達(dá)譜。Ma等[38]從GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了3個(gè)數(shù)據(jù)集，分別是gefitinib耐藥的GSE34228，erlotinib耐藥的GSE38310，crizotinib或X-376耐藥的GSE49508。他們隨后分析了這3個(gè)數(shù)據(jù)集的lncRNA表達(dá)譜。GSE34228的數(shù)據(jù)分析顯示114個(gè)lncRNAs表達(dá)失調(diào)，其中59個(gè)lncRNAs表達(dá)上調(diào)，55個(gè)lncRNAs表達(dá)下調(diào)。GSE38310的分析結(jié)果表明，在ER3細(xì)胞中有43個(gè)lncRNAs表達(dá)失調(diào)，另有45個(gè)lncRNAs表達(dá)失調(diào)在T15-2克隆中。有9個(gè)lncRNAs在2個(gè)組中均表達(dá)上調(diào)，13個(gè)lncRNAs表達(dá)下調(diào)。分析GSE49508的結(jié)果顯示，在PF-1066耐藥和X-376耐藥的H3122細(xì)胞中分別有51個(gè)lncRNAs和107個(gè)lncRNAs表達(dá)失調(diào)。其中9個(gè)lncRNAs表達(dá)上調(diào)、18個(gè)lncRNAs表達(dá)下調(diào)。作者從這些表達(dá)失調(diào)的lncRNAs中選取了上調(diào)的CASC9和下調(diào)的EWAST1（LINC00227）作為研究對(duì)象，用Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算與之共表達(dá)的蛋白編碼基因（protein-coding genes, PCGs）。結(jié)果表明，CASC9共表達(dá)的PCGs主要與選擇性剪接、蛋白-DNA相互作用、核小體組裝、外泌體、甲基化等功能有關(guān)。LINC00277共表達(dá)的PCGs主要參與蛋白磷酸化調(diào)節(jié)、蛋白結(jié)合、免疫反應(yīng)等。推測(cè)CASC9和LINC00277可能通過(guò)與這些PCGs相互作用調(diào)節(jié)EGFR-TKIs耐藥。

差異表達(dá)的lncRNAs可以作為逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs耐藥的候選靶點(diǎn)。Cheng等[39]分析了EGFR-TKIs敏感的PC9和耐藥的PC9/R肺癌細(xì)胞的lncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)二者之間共有22,587個(gè)lncRNAs和17,479個(gè)mRNAs差異表達(dá)。其中1,731個(gè)lncRNAs和2,349個(gè)mRNAs在PC9/R細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，2,936個(gè)lncRNAs和1,307個(gè)mRNAs在PC9/R細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。共有699個(gè)基因與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)。GO分析結(jié)果表明，上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本主要負(fù)責(zé)細(xì)胞代謝過(guò)程、細(xì)胞內(nèi)組分、蛋白結(jié)合等。下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本主要負(fù)責(zé)泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞外空間以及蛋白結(jié)合等。Pathway分析結(jié)果表明，上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本主要涉及RNA運(yùn)輸、溶酶體、spliceosome等19條信號(hào)通路。下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本主要涉及沙門氏菌感染、花生四烯酸代謝、legionellosis等17條信號(hào)通路。這其中與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的信號(hào)通路在EGFR-TKIs耐藥中發(fā)揮重要作用。作者隨后采用RT-qPCR方法驗(yàn)證了4個(gè)lncRNAs（H19、BC200、MALAT1、HOTAIR）的表達(dá)，以證明這些lncRNAs可能作為EGFRTKIs治療的潛在靶點(diǎn)。這項(xiàng)研究的完成給了我們很多啟示。已知lncRNAs可以調(diào)節(jié)鄰近的蛋白編碼基因的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)上調(diào)的lncRNA-BC087858位于一個(gè)與癌癥發(fā)展相關(guān)的FOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員FOXC1（forkhead box protein C1）附近。FOXC1可以通過(guò)抑制E-cadherin表達(dá)誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。FOXC1的表達(dá)也可以被EGF/ERK（epidermal growth factor/extracellular signal-related kinase）信號(hào)通路激發(fā)[40]。因此作者推測(cè)BC087858可能通過(guò)EMT在EGFR-TKIs耐藥中發(fā)揮作用。又比如lncRNARP11-15H7.2位于CITED2附近，而CITED2是一個(gè)與癌癥有關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，被報(bào)道與順鉑耐藥相關(guān)[41]。因此，lncRNA-RP11-15H7.2也可能在EGFR-TKIs耐藥中發(fā)揮作用。

LncRNAs調(diào)節(jié)RNA的剪接、穩(wěn)定、核質(zhì)穿梭，因此蛋白編碼RNAs和lncRNAs的共表達(dá)分析可以反映lncRNAs的功能。Xue等[42]利用GEO的數(shù)據(jù)集GSE49644和GSE60189構(gòu)建了肺癌耐藥的lncRNAs-mRNAs共表達(dá)功能性網(wǎng)絡(luò)。他們首先分析了mRNA和lncRNA表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)顯著的34個(gè)lncRNAs和103個(gè)mRNAs。其中10個(gè)lncRNAs和49個(gè)mRNAs表達(dá)下調(diào)，24個(gè)lncRNAs和54個(gè)mRNAs表達(dá)上調(diào)。GO分析顯示差異表達(dá)的mRNAs主要涉及一些與癌癥相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K-Akt、p53、VEGF、Hippo通路。共表達(dá)分析結(jié)果表明有32個(gè)lncRNAs和81個(gè)mRNAs相互調(diào)節(jié)，其中起關(guān)鍵作用的是COL1A1、COL27A1、BMPR2等。作者接著分析了這些lncRNAs和mRNAs與肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)7個(gè)mRNAs和8個(gè)lncRNAs與患者的生存相關(guān)。2對(duì)lncRNA-mRNA與耐藥高度相關(guān)。其中l(wèi)ncRNA（NR_028502.1/NR_028505.1）-MIR22HG（MIR22 host gene）與9個(gè)mRNAs共表達(dá)，可能在耐藥中發(fā)揮抵抗作用，與肺癌患者更好的臨床預(yù)后有關(guān)。lncRNA（NR_030725.1/NR_030726.1）-RCC1（regulator of chromosome condensation 1）與11個(gè)mRNAs共表達(dá)，可能促進(jìn)耐藥，與肺癌患者生存率差有關(guān)。這項(xiàng)研究的不足之處在于沒(méi)有排除lncRNAs所具有的其他功能如染色質(zhì)重塑、啟動(dòng)子甲基化、microRNA沉默的可能性等。

Wu等[43]分析了對(duì)gefitinib耐藥的HCC827-8-1和親本細(xì)胞HCC827的lncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有1,476個(gè)lncRNAs（703個(gè)上調(diào)、773個(gè)下調(diào)）和1,026個(gè)mRNAs（516個(gè)上調(diào)、510個(gè)下調(diào)）表達(dá)失調(diào)。失調(diào)的mRNAs主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞外空間和受體結(jié)合等，涉及到的KEGG pathways主要與移植物抗宿主病、I型糖尿病、病毒性心肌炎等有關(guān)。作者通過(guò)分析與lncRNAs共表達(dá)的mRNAs預(yù)測(cè)表達(dá)失調(diào)的lncRNAs的作用。結(jié)果表明這些lncRNAs主要在代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、N-聚糖生物合成等信號(hào)途徑中發(fā)揮作用。這項(xiàng)研究的結(jié)果為深入研究EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制提供了很多啟示，作者在構(gòu)建的lncRNA-TF（transcription factors）網(wǎng)絡(luò)中，篩選出了4個(gè)關(guān)鍵基因：E2F4、E2F1、uSF1、TFAP2C。它們可能在EGFR-TKIs耐藥中發(fā)揮重要作用，值得繼續(xù)關(guān)注。

3.2 實(shí)驗(yàn)研究lncRNAs在NSCLC EGFR-TKIs耐藥中的作用迄今為止報(bào)道的lncRNAs與NSCLC耐藥的研究多聚焦于順鉑等化療藥物的耐藥[2,3,28,44,45]。有關(guān)lncRNAs在EGFR-TKIs耐藥中的作用的研究報(bào)道尚不多見(jiàn)。

LncRNA-UCA1（urothelial cancer-associated 1）與細(xì)胞凋亡、增殖、化療耐藥相關(guān)[39]。Cheng等[39,46]研究了NSCLC中l(wèi)ncRNA UCA1在EGFR-TKIs獲得性耐藥中的作用。結(jié)果表明，gefitinib耐藥的PC9/R和H1975細(xì)胞過(guò)表達(dá)UCA1。相應(yīng)的gefitinib獲得性耐藥的NSCLC患者UCA1 mRNA表達(dá)顯著增加并且與患者的不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性僅存在于沒(méi)有T790M突變的NSCLC患者中。作者進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)。Western blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UCA1與pEGFR、pAKT、pERK、pmTOR表達(dá)正相關(guān)。沉默UCA1表達(dá)使EMT相關(guān)的E-cadherin表達(dá)增強(qiáng)，vimentin、Snail、N-cadherin表達(dá)減弱。因此，UCA1可能通過(guò)活化AKT/mTOR和ERK通路和EMT促進(jìn)gefitinib耐藥。

已報(bào)道lncRNA BC087858在gefitinib耐藥的NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)[39]。Pan等[47]檢測(cè)了不同NSCLC細(xì)胞和EGFRTKIs耐藥的腫瘤組織中l(wèi)ncRNA BC087858的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)lncRNA BC087858的NSCLC患者預(yù)后差。值得注意的是，這種顯著的相關(guān)性也主要發(fā)生在T790M突變陰性的NSCLC患者中。體外siRNA-BC087858轉(zhuǎn)染能夠逆轉(zhuǎn)T790M突變陰性的NSCLC耐藥細(xì)胞對(duì)gefitinib的抗性并促進(jìn)細(xì)胞凋亡和遷移。機(jī)制研究的結(jié)果表明，BC087858能夠通過(guò)上調(diào)Snail和ZEB1表達(dá)促進(jìn)EMT，也能通過(guò)上調(diào)pEGFR、pAKT、pERK表達(dá)活化PI3K/AKT和MEK/ERK信號(hào)通路，從而促進(jìn)EGFR-TKIs耐藥。

Wang等[48]分析了對(duì)gefitinib耐藥的PC9-R細(xì)胞和親本細(xì)胞的lncRNA表達(dá)譜之間的差異。結(jié)果表明PVT1、H19、MIR31HG、BOK-AS1、CBR3-AS1、LincRNA-p21差異表達(dá)。尤其是PVT1、MIR31HG、LincRNA-p21在耐藥細(xì)胞中顯著上調(diào)。轉(zhuǎn)染siRNA-MIR31HG的PC9-R細(xì)胞對(duì)gefitinib的敏感性恢復(fù)。細(xì)胞凋亡率顯著增加。細(xì)胞周期阻滯在G0期/G1期。Western blot結(jié)果表明，MIR31HG通過(guò)促進(jìn)p-EGFR、p-PI3K、p-AKT、p-Mdm-2表達(dá)活化EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路在gefitinib耐藥中發(fā)揮作用。

一個(gè)已知的LncRNA，GAS5（growth arrest-specific transcript 5）被報(bào)道在肺癌組織中表達(dá)降低[49]，并與較大的腫瘤體積、低分化、較高的TNM分期相關(guān)。Dong等[50]報(bào)道過(guò)表達(dá)GAS5能夠逆轉(zhuǎn)A549細(xì)胞對(duì)gefitinib耐藥，這主要是由于過(guò)表達(dá)GAS5使p-EGFR、p-ERK、p-Akt、p-IGFIR（insulin-like growth factor 1 receptor）的表達(dá)顯著降低。本研究的一個(gè)亮點(diǎn)是作者通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，這對(duì)于后續(xù)的研究具有重要的指導(dǎo)意義。有報(bào)道[51]一個(gè)lncRNA SNHG12（small nucleolar RNA host gene 12）在NSCLC多藥耐藥中發(fā)揮作用。作者發(fā)現(xiàn)SNHG12在NSCLC細(xì)胞系和腫瘤組織中高表達(dá)。沉默SNHG12可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞對(duì)cisplatin、paclitaxel、gefitinib的耐藥。進(jìn)一步的研究表明，SNHG12沉默通過(guò)上調(diào)miR-181a抑制MAPK1和MAP2K1表達(dá)，導(dǎo)致MAPK/Slug通路被抑制。該研究的不足之處在于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)僅驗(yàn)證了SNHG12對(duì)cisplatin治療的調(diào)節(jié)作用。最近Wu等[52]報(bào)道gefitinib耐藥細(xì)胞中LINC00635-001高表達(dá)。沉默LINC00635-001并沒(méi)有對(duì)耐藥的HCC827-8-1細(xì)胞產(chǎn)生影響。但是lncRNA沉默和gefitinib處理具有協(xié)同作用，可通過(guò)抑制AKT活化恢復(fù)耐藥細(xì)胞對(duì)gefitinib的敏感性。

上述對(duì)lncRNAs在EGFR-TKIs耐藥中的作用的研究報(bào)道多采用篩選差異表達(dá)lncRNAs并構(gòu)建lncRNA與mRNA或蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)等生物信息學(xué)分析方法來(lái)進(jìn)行，后續(xù)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和機(jī)制研究的報(bào)道還比較少見(jiàn)。分析原因除了樣本的獲得有難度之外，lncRNAs的非保守性和功能的多樣性也為未來(lái)的研究帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。Sponge途徑是lncRNAs發(fā)揮作用的經(jīng)典方式，通過(guò)雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)即可初步闡明lncRNAs的作用機(jī)制，但是ceRNA調(diào)控必須在對(duì)應(yīng)的miRNA和lncRNA達(dá)到一定豐度時(shí)才能發(fā)揮作用。因此需要通過(guò)Northern blot和FISH等實(shí)驗(yàn)證明所研究的miRNA和lncRNA的高表達(dá)和胞漿分布，這無(wú)疑會(huì)使很多候選的lncRNAs被淘汰。另外，大多數(shù)的lncRNAs都分布于核中，因此lncRNAs對(duì)基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控才是其主要的作用方式。這就需要進(jìn)行RNA pull down、質(zhì)譜檢測(cè)等有難度的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。相信隨著生物信息學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，lncRNAs相關(guān)的算法和數(shù)據(jù)庫(kù)會(huì)更加完善，針對(duì)lncRNAs的預(yù)測(cè)結(jié)果也會(huì)更加準(zhǔn)確，從而可以使未來(lái)的研究進(jìn)程加速進(jìn)行[53]。

4 問(wèn)題與展望

在目前的臨床治療中NSCLC EGFR-TKIs耐藥仍是需要重點(diǎn)解決的問(wèn)題。因此探究 EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制，尋找有效的克服耐藥的手段至關(guān)重要。非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)為研究EGFR-TKIs的耐藥提供了新的思路，同時(shí)也意味著更復(fù)雜的耐藥機(jī)制需要被闡明。lncRNAs是長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用。隨著越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs廣泛參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，它們有望作為一類極有前途的組織和/或血液系統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物在臨床治療中發(fā)揮作用。本文綜述了lncRNAs在NSCLC患者EGFR-TKIs耐藥中的作用。這些lncRNAs既可以作為耐藥的標(biāo)志，也可以作為診斷和治療的新靶點(diǎn)。目前最重要的問(wèn)題是需要對(duì)它們進(jìn)行詳細(xì)的研究并早日在臨床應(yīng)用。眾所周知，絕大多數(shù)lncRNAs的作用機(jī)制和生物學(xué)功能現(xiàn)在都是未知的，因此未來(lái)的工作面臨巨大的挑戰(zhàn)。要早日實(shí)現(xiàn)這樣的目標(biāo)需要基礎(chǔ)研究工作者和臨床醫(yī)生通力合作并綜合利用多種新技術(shù)新方法，例如建立精確調(diào)節(jié)lncRNAs表達(dá)的實(shí)驗(yàn)體系、獲得足夠的研究樣本等。可喜的是，最近生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展已經(jīng)大大加速了lncRNAs的研究進(jìn)程。其他新近發(fā)展的技術(shù)如CRISPR-Cas9系統(tǒng)等也可以幫助我們進(jìn)行有效靶向基因組的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。期待在不遠(yuǎn)的將來(lái)有更多的腫瘤患者能夠在精準(zhǔn)治療中獲得更好的臨床療效。