動(dòng)物細(xì)小病毒致病機(jī)制的研究進(jìn)展

楊一鳴，姜 萌，鄢雨晴，何天琦，董 浩

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

細(xì)小病毒是一類目前發(fā)現(xiàn)存在于自然界中形態(tài)最小的動(dòng)物病毒，該病毒表面無(wú)囊膜，由正二十面體的衣殼包裹[1]。該病毒現(xiàn)已呈世界性感染，自然感染宿主范圍廣泛。目前感染較為廣泛的幾種細(xì)小病毒包括豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)、貓細(xì)小病毒(Feline parvovirus，F(xiàn)PV)和鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)。

豬細(xì)小病毒是由Mary和Mahnel在1966年首次發(fā)現(xiàn)，主要感染動(dòng)物是豬，可引起母豬發(fā)生繁殖障礙病，其在豬群中檢出率甚高，是目前導(dǎo)致胚胎和胎兒死亡的主要病毒。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，感染PPV后可導(dǎo)致仔豬腹瀉、發(fā)生皮炎及呼吸系統(tǒng)疾病，同時(shí)與多種疾病有關(guān)，如仔豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬非化膿性心肌炎和豬消瘦綜合癥。PPV在豬群中的血清抗體陽(yáng)性率高達(dá)50%～80%，因此給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]，嚴(yán)重影響和制約著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

犬細(xì)小病毒最早是在1977年由美國(guó)學(xué)者Eugster和Nairnl發(fā)現(xiàn)，該病毒自發(fā)現(xiàn)以來(lái)就一直在世界范圍內(nèi)傳播。研究發(fā)現(xiàn)，CPV從抗原性角度與FPV關(guān)系密切，當(dāng)前研究表明因突變而產(chǎn)生。在體外環(huán)境下，F(xiàn)PV只可感染組織培養(yǎng)的貓細(xì)胞，而CPV-2可致使組織培養(yǎng)的犬細(xì)胞和貓細(xì)胞感染，但無(wú)法感染貓。CPV與FPV在DNA序列上同源性高達(dá)99%，因此，學(xué)者們普遍認(rèn)為，CPV是由FPV發(fā)生基因突變而產(chǎn)生的。CPV對(duì)于不同年齡及品種的犬都易感，且死亡率高達(dá)20%～100%[3]，給當(dāng)前養(yǎng)犬業(yè)帶來(lái)巨大的危害[4]。

貓細(xì)小病毒在1928年被Verge等學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)，后分別在1957年、1964年被Bilin、Johnson分離出來(lái)，目前已在世界各地廣泛分布和傳播。FPV是一種典型的肉食獸細(xì)小病毒，其感染范圍大，包括貓及其他貓科成員、熊科動(dòng)物(如浣熊、大熊貓等)、臭鼬、水貂、狐貍等[5-6]。FPV對(duì)感染動(dòng)物并無(wú)年齡限制，但幼貓易感性最強(qiáng)，感染該病的幼貓死亡率可高達(dá)90%以上，且該病的傳染性極強(qiáng)，經(jīng)常使整窩幼貓同時(shí)發(fā)病或陸續(xù)發(fā)病。

鵝細(xì)小病毒在1956年被我國(guó)學(xué)者方定一首次發(fā)現(xiàn)，由匈牙利學(xué)者Derzsy在1966年首次公開并在1971年確定小鵝瘟病原為GPV[7]，在1995年Zadori等學(xué)者獲得其全基因組序列。研究發(fā)現(xiàn)，該病毒可在雛鵝及雛番鴨群中引起小鵝瘟病，但對(duì)其他禽類及哺乳動(dòng)物尚未發(fā)現(xiàn)感染性。其致病性及死亡率極高，是養(yǎng)鵝業(yè)中極為重視的疾病之一[8]。由于該病所造成的經(jīng)濟(jì)損失較為嚴(yán)重，所以自發(fā)現(xiàn)以來(lái)對(duì)小鵝瘟的研究和防控做了大量的研究工作。

作為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，動(dòng)物細(xì)小病毒致病機(jī)制研究成果較少，為了更好地了解動(dòng)物細(xì)小病毒及其致病機(jī)制，對(duì)4種動(dòng)物細(xì)小病毒致病機(jī)制研究成果進(jìn)行整理，為動(dòng)物細(xì)小病毒研究提供一些借鑒。

1 4種細(xì)小病毒病原學(xué)

細(xì)小病毒不具有囊膜，含有球形20面體對(duì)稱衣殼，為單股DNA病毒。病毒粒子呈六角形或圓形[9]。

1.1 豬細(xì)小病毒

PPV直徑為20～28 nm，核衣殼由32個(gè)殼粒組成。可凝集人、猴、貓、雞、小鼠、豚鼠等動(dòng)物的紅細(xì)胞。相對(duì)于一般的病毒，PPV對(duì)高溫和酸堿性環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)。在56 ℃環(huán)境下加熱48 h，病毒傳染性、凝集紅細(xì)胞能力均無(wú)明顯變化。在70 ℃條件下加熱2 h，病毒仍存在感染力但有所下降。在80 ℃條件下加熱5 min后觀察發(fā)現(xiàn)，PPV失去活性。在甲醛蒸汽情況下需較長(zhǎng)時(shí)間才可滅活，在20% NaOH溶液中需至少5 min，或在0.5%漂白粉及2% NaOH溶液中5 min，或在3%甲醛溶液中1 h可滅活[10]。

1.2 犬細(xì)小病毒

CPV直徑為20 nm，其抗原性與貓細(xì)小病毒及水貂腸炎病毒關(guān)系密切。在4 ℃條件下可使豬、恒河猴的紅細(xì)胞發(fā)生凝集。CPV具有很強(qiáng)的抵抗力，對(duì)于大多數(shù)的理化因素及試劑抗性都較強(qiáng)。在4～10 ℃環(huán)境下可存活6個(gè)月，在37 ℃環(huán)境下可存活2周左右，在56 ℃下可存活24 h，80 ℃條件下可存活15 min。CPV在糞便中可存活數(shù)月甚至數(shù)年之久。CPV對(duì)于乙醚、氯仿有機(jī)溶劑及醇類試劑有著一定的抵抗力，但對(duì)于紫外線、福爾馬林、甲醛、次氯酸鈉、氧化劑較為敏感。

1.3 貓細(xì)小病毒

FPV直徑為20～24 nm。FPV在4 ℃、pH值為6.5～6.8環(huán)境中對(duì)豬紅細(xì)胞凝集，pH值過(guò)低時(shí)會(huì)出現(xiàn)紅細(xì)胞自凝現(xiàn)象，該情況下需加入0.05%的牛血白蛋白或0.5%滅活的兔血清作為穩(wěn)定劑。FPV具有較強(qiáng)抵抗力，在65 ℃環(huán)境中加熱30 min不會(huì)完全失去活力。對(duì)于酸、堿、酚、乙醚、胰蛋白、氯仿及丙酮等脂溶性溶劑均有抵抗力。使用0.5%的福爾馬林和0.175%的次氯酸鈉可有效地滅活病毒。

1.4 鵝細(xì)小病毒

GPV直徑為20～25 nm。根據(jù)國(guó)外學(xué)者報(bào)道，GPV可使黃牛的精子凝集。不能凝集雞、鴨、鵝、羊、兔、豚鼠和小鼠的紅細(xì)胞[11]。GPV在不良環(huán)境下的抵抗力較強(qiáng)，在37 ℃、pH值3.0環(huán)境下作用1 h，仍能保持其感染性。在56 ℃環(huán)境中3 h，仍具有活性[12]。GPV對(duì)乙醚和脂溶性試劑不敏感。

2 4種細(xì)小病毒分子生物學(xué)特征

細(xì)小病毒的基因組中主要的開放閱讀框架有2個(gè)，分別為3′端編碼的結(jié)構(gòu)蛋白VP與5′端編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS。

2.1 豬細(xì)小病毒

PPV基因組長(zhǎng)度約為5 000 bp，基因組兩端均有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。PPV兩端均為回文結(jié)構(gòu)，5′端長(zhǎng)度為127 bp，形成U形結(jié)構(gòu)，3′端長(zhǎng)度為102 bp，形成Y形結(jié)構(gòu)。Molitor等[12]研究表明，PPV無(wú)論毒株強(qiáng)弱在VP2基因759—917位點(diǎn)處均有連續(xù)的158個(gè)堿基，該段基因序列為PPV所特有。VP2是PPV主要的衣殼蛋白，通過(guò)研究表明，缺失VP2蛋白的突變體會(huì)導(dǎo)致病毒喪失對(duì)宿主細(xì)胞的再感染能力[13]。通過(guò)研究分析，NS1作為PPV的反式激活蛋白，在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起到至關(guān)重要的作用，特別是NS1的磷酸化及糖基化功能。

2.2 犬細(xì)小病毒

CPV基因組中含有2個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，分別為P4和P38啟動(dòng)子，P4啟動(dòng)子主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄非結(jié)構(gòu)蛋白NS1及NS2，P38啟動(dòng)子主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)蛋白VP1及VP2。CPV的VP1基因大小約為2 256 bp， 當(dāng)中也包含VP2基因的完整閱讀框架。在CPV中VP1與VP2結(jié)構(gòu)極為相似，區(qū)別在于VP1的N端較VP2多出特有的143個(gè)氨基酸殘基序列，其中VP2基因全長(zhǎng)1 755 bp，編碼584 個(gè)氨基酸[14]。而作為自主性細(xì)小病毒特有的VP3僅在完整的病毒粒子衣殼蛋白中存在。在CPV、FPV研究中發(fā)現(xiàn)，Poly(A)序列下游具有TATA序列，TATA序列是RNA多聚酶起始轉(zhuǎn)錄識(shí)別部位，位于5′端帽子部位上游序列30—35 bp處。前人研究表明，細(xì)小病毒中VP2蛋白的表面具有“抗受體”，能夠與細(xì)胞上的受體結(jié)合并啟動(dòng)內(nèi)化過(guò)程[15]。由此證明，VP2蛋白在病毒增殖過(guò)程中，決定病毒的宿主范圍，對(duì)結(jié)合及進(jìn)入細(xì)胞等都起到重要作用。

2.3 貓細(xì)小病毒

FPV基因組長(zhǎng)約5 200 bp。FPV同樣具有回文結(jié)構(gòu)，其中3′端的結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度固定，但5′端的結(jié)構(gòu)長(zhǎng)短不一，可含有1～3個(gè)重復(fù)序列，這2個(gè)回文結(jié)構(gòu)與FPV基因組的復(fù)制密切相關(guān)，能夠使宿主細(xì)胞的RNA聚合酶Ⅱ分別啟動(dòng)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)轉(zhuǎn)錄。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PV或CPV的基因組具有互補(bǔ)性，即在病毒粒子中部分DNA分子有正極性，同時(shí)還有部分DNA分子有負(fù)極性。而在近期研究中表明，只有負(fù)極性的DNA鏈才可以被包裝進(jìn)入病毒粒子中。

2.4 鵝細(xì)小病毒

GPV基因組長(zhǎng)度約為5 106 bp。其中包括2個(gè)開放閱讀框，兩者間隔18個(gè)堿基，同時(shí)兩端含有末端倒置重復(fù)序列(ITR)：左側(cè)的ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)，產(chǎn)生于病毒復(fù)制的早期，也稱Rep蛋白；右側(cè)的ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3)，編碼核酸數(shù)分別為2 199 nt、1 764 nt和1 605 nt。VP1和VP3的起始密碼子是較為常見(jiàn)的AUG，而VP2則是以不典型的ACG為起始密碼子。目前發(fā)現(xiàn)的所有GPV毒株的VP2起始密碼子均為ACG，具有高度的保守性。VP1對(duì)病毒感染有著重要作用，可幫助病毒或DNA順利進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部，或與宿主細(xì)胞的特殊受體結(jié)合，使病毒進(jìn)行有效的感染。VP2是主要免疫功能區(qū)，具有免疫原性，可通過(guò)刺激機(jī)體使其產(chǎn)生抗體。有研究對(duì)GPV氨基酸序列進(jìn)行配對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)VP3中含有GPV主要抗原決定簇成分，由此推斷，VP3是決定病毒毒力的基因[16]。

3 4種細(xì)小病毒致病機(jī)制

3.1 豬細(xì)小病毒

Oraveerakul等[17]為了解2株P(guān)PV毒株致病性不同的原因，利用原位雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)兩毒株在豬胎兒體內(nèi)復(fù)制部位及數(shù)量上的差異，結(jié)果表明，對(duì)于不同毒株，其DNA的復(fù)制具有組織選擇性，不同組織中病毒含量有所不同。Bergeron等[18]研究認(rèn)為，PPV的非結(jié)構(gòu)蛋白及結(jié)構(gòu)蛋白決定著該病毒的宿主范圍。李厚偉等[19]研究檢測(cè)確定PPV感染定植部位為母豬的子宮，由此推斷，PPV對(duì)宿主的致病部位主要是在繁殖器官，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，就仔豬而言，病毒主要集中在其腎臟、脾臟和腸道淋巴結(jié)部位。姜永厚等[20]利用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)感染豬不同臟器中的病毒分布情況，檢出結(jié)果分別為：肝臟中含量為22.7%，心臟中含量為36.4%，脾臟中含量為50%，腎臟中含量為66.7%。PPV在感染妊娠母豬后，可使其黃體發(fā)生萎縮，導(dǎo)致失去抑制排卵及分泌孕酮的能力。前人研究證明，PPV誘導(dǎo)宿主炎癥反應(yīng)[21]。當(dāng)前PK-15細(xì)胞是一種已知的豬腎上皮細(xì)胞系，被證明是研究PPV激活的NF-κB信號(hào)通路的合適細(xì)胞系，當(dāng)PPV感染PK-15后，NF-κB基因活性提高，Jak1基因表達(dá)量增加，據(jù)此推測(cè)PK-15細(xì)胞可通過(guò)激活NF-κB依賴性途徑和JAK/STAT途徑來(lái)抵抗PPV感染[22]。

3.2 犬細(xì)小病毒

Raj等[23]研究表明，CPV導(dǎo)致犬急性出血性腸胃炎，并且主要由于VP2基因的突變而易于遺傳進(jìn)化。CPV主要的自然感染方式為口腔感染，因此病毒的定植部位大多數(shù)為口腔咽鼻(包括扁桃腺及其他淋巴組織)。經(jīng)過(guò)血液傳播病毒對(duì)其他器官進(jìn)行感染，一般情況下感染后的1～3 d可在扁桃體、咽淋巴結(jié)、胸腺、胸淋巴結(jié)中檢測(cè)到CPV，在感染的3 d后，腸腔的相關(guān)淋巴結(jié)組織內(nèi)均可檢測(cè)到CPV。Hoelzer等[24]發(fā)現(xiàn)，CPV的復(fù)制發(fā)生在迅速分裂的小腸的絨毛上皮細(xì)胞中，CPV在宿主中主要攻擊2種細(xì)胞，分別為腸上皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞。感染腸腺胚上皮組織后，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法正常代謝更新，從而引起上皮組織被破壞，腸絨毛變短，腸腺上皮細(xì)胞發(fā)生不同程度的壞死、脫落。當(dāng)CPV感染心肌細(xì)胞時(shí)，病毒在心肌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行大量增殖，心肌毛細(xì)血管發(fā)生擴(kuò)張及充血現(xiàn)象，同時(shí)淋巴和骨髓增殖細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少。因此，當(dāng)CPV感染嚴(yán)重時(shí)會(huì)伴隨出現(xiàn)淋巴細(xì)胞減少癥和中性粒細(xì)胞減少癥。Nho等[25]利用原位雜交法對(duì)石蠟組織切片中的CPV進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，在同一幼犬體內(nèi)肝臟、腎臟及心臟組織中均存在CPV，說(shuō)明CPV侵害器官組織種類范圍逐漸擴(kuò)大。

3.3 貓細(xì)小病毒

FPV通常最初是在宿主的口咽部定植復(fù)制，隨后將會(huì)發(fā)生病毒血癥2～7 d，在其過(guò)程中病毒分布在全身的各個(gè)組織中。由于細(xì)小病毒的特性，F(xiàn)PV主要侵害快速分化或分裂的組織，例如幼獸的腸上皮細(xì)胞及骨髓或是妊娠母獸的胎盤及胎兒等。FPV在感染6周齡以上貓中，淋巴組織、骨髓及腸黏膜最常受到影響。在感染淋巴組織時(shí)，F(xiàn)PV可使細(xì)胞衰竭從而引起免疫抑制。在病毒作用過(guò)程中淋巴細(xì)胞不僅出現(xiàn)直接溶解現(xiàn)象，同時(shí)淋巴細(xì)胞也會(huì)遷移到組織中。FPV會(huì)阻礙腸內(nèi)隱窩中的細(xì)胞黏膜的快速?gòu)?fù)制但對(duì)不分開的吸收細(xì)胞尖端絨毛不產(chǎn)生影響。由于隱窩細(xì)胞受到破壞致使腸絨毛損傷，使患病動(dòng)物吸收不良而產(chǎn)生腹瀉。

3.4 鵝細(xì)小病毒

當(dāng)前GPV的致病機(jī)制研究仍不十分清楚，且相關(guān)研究報(bào)道較少。關(guān)于宿主細(xì)胞的種類區(qū)別、細(xì)胞受體的類型劃分及跨膜侵染機(jī)制等研究均未見(jiàn)報(bào)道，近年來(lái)GPV致病機(jī)制研究越來(lái)越受到人們的重視，特別是GPV在患病雛鵝體內(nèi)的定植部位、病毒復(fù)制機(jī)制等。通過(guò)資料了解GPV在宿主體內(nèi)各組織的分布情況，GPV最終定植部位可能為腸道上皮細(xì)胞。通過(guò)PCR方式檢測(cè)病鵝體內(nèi)病毒含量情況，發(fā)現(xiàn)在感染后24 h內(nèi)即可在心臟、肝臟、肺部、腎臟、脾臟、十二指腸、空腸、胸腺等部位檢測(cè)到GPV，在感染的第3天在盲腸內(nèi)檢測(cè)到GPV，在感染的第4天在糞便及大腦中檢測(cè)GPV呈陽(yáng)性，在感染的第5天在食道中檢測(cè)到GPV。而在感染后的第6天開始發(fā)現(xiàn)，GPV在各組織中含量逐漸降低甚至消失，首先檢測(cè)GPV呈陰性的部位為肝臟，后在盲腸及血液中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)GPV檢測(cè)為陰性的情況。感染GPV后，病毒侵染空腸盲腸使其發(fā)生急性亞急性卡他性-纖維素性壞死性炎癥，逐漸出現(xiàn)固有膜結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞發(fā)生彌漫性浸潤(rùn)，大多數(shù)腸腺結(jié)構(gòu)被破壞，上皮細(xì)胞壞死脫落，腦膜充血，神經(jīng)細(xì)胞變性等病變。根據(jù)多位學(xué)者的研究分析推測(cè)，GPV的Rep蛋白對(duì)于GPV的病毒增殖、病毒對(duì)宿主細(xì)胞的作用及其毒性影響都有著重要作用。對(duì)GPV結(jié)構(gòu)基因序列比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)蛋白中有3個(gè)糖基化位點(diǎn)與番鴨細(xì)小病毒(MDPV)相同。在氨基酸序列方面，GPV與MDPV在440—530位的變化較大，在結(jié)構(gòu)蛋白中的443—445位上GPV為NFN，在MDPV上則是NFS；在493—495位上GPV為NWN，相同位置MDPV為NWS。

4 小結(jié)及展望

目前，關(guān)于細(xì)小病毒致病機(jī)制研究雖然較多，但進(jìn)展仍然較慢。細(xì)小病毒因其自身?xiàng)l件限制，主要選擇侵害宿主體內(nèi)分化較快、分裂迅速的組織，其中包括新生組織、胎兒及胎兒新生組織及成年動(dòng)物的淋巴系統(tǒng)。在成年動(dòng)物的淋巴系統(tǒng)中，腸上皮組織含有極多的分裂細(xì)胞源，由此成為細(xì)小病毒的主要感染目標(biāo)。在細(xì)小病毒致病機(jī)制研究中，可考慮對(duì)宿主體內(nèi)分化較快、分裂迅速的組織及細(xì)胞內(nèi)病毒作用進(jìn)行研究。在PPV致病機(jī)制試驗(yàn)中，可對(duì)PK-15細(xì)胞的作用多加研究。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒和宿主細(xì)胞的吸附產(chǎn)生影響，由此可推測(cè)，糖基化位點(diǎn)的差異與病毒感染宿主的特異性有密切關(guān)聯(lián)。在研究細(xì)小病毒致病機(jī)制方面，應(yīng)對(duì)以上內(nèi)容加以深入探討。目前，隨著寵物數(shù)量的急劇增長(zhǎng)，寵物疾病也逐漸得到重視，而作為患病數(shù)較多、危害較高的細(xì)小病毒流行也日益廣泛，為找到高效安全的預(yù)防和治療手段，細(xì)小病毒致病機(jī)制的研究體現(xiàn)了極大的重要性。