卵巢內(nèi)生殖干細(xì)胞的研究進(jìn)展和應(yīng)用

李廣瑩，石 紅

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 大連116011)

雄性哺乳動物中，由于精原干細(xì)胞的存在，在整個生命周期中，精子可以不斷地產(chǎn)生。但是，雌性個體出生后的卵巢中擁有固定的卵泡數(shù)目并且數(shù)量逐漸下降已獲得普遍共識。早在1951年，卵巢功能不全及老化和損傷引起的不孕就表明出生后卵巢內(nèi)的卵泡數(shù)不能自我更新［1］。但是近來，隨著出生后卵巢中存在卵泡更新和生殖干細(xì)胞的相關(guān)研究結(jié)果的不斷發(fā)表，這一認(rèn)識正發(fā)生改變。

1 小鼠卵巢中生殖干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)

2004年，Johnson 等［2］首次報道，幼鼠及成年鼠卵巢中，具有有絲分裂活性的生殖細(xì)胞，并可持續(xù)更新卵泡池。他根據(jù)對卵巢中健康卵泡和退化閉鎖卵泡的數(shù)量進(jìn)行分析，認(rèn)為根據(jù)出生后小鼠卵巢中卵泡的閉鎖速率，卵泡理應(yīng)很快消耗殆盡，而事實(shí)卻與之相反，在13 ～14 個月齡的小鼠中才發(fā)生，非閉鎖卵泡數(shù)目與閉鎖速度相比下降較慢。對位于卵巢上皮層的大卵圓形細(xì)胞進(jìn)行免疫組化分析及增殖標(biāo)記(MVH、BrdU、SCB)染色分析使他們認(rèn)為出生后的小鼠卵巢中有生殖細(xì)胞的增殖和卵泡更新。在用白消安處理后的不孕小鼠卵巢中，仍發(fā)現(xiàn)具有非閉鎖卵母細(xì)胞的健康卵泡，并有顯示排卵的黃體存在，這進(jìn)一步說明存在能補(bǔ)充卵泡數(shù)的增殖性生殖細(xì)胞。同時發(fā)現(xiàn)在幼鼠及成鼠卵巢中具有表達(dá)減數(shù)分裂聯(lián)合復(fù)合物蛋白3 的細(xì)胞。將野生型小鼠的卵巢組織移植到表達(dá)綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)的雌性轉(zhuǎn)基因小鼠卵巢后，發(fā)現(xiàn)移植的卵巢中產(chǎn)生了能表達(dá)GFP 的卵母細(xì)胞。因此，通過這一系列實(shí)驗，他們認(rèn)為出生后的小鼠卵巢中有GSCs，而且位于卵巢表面大的、呈卵圓形的生殖細(xì)胞有可能是GSCs。

2005年，Bukovsky 等［3］證實(shí)新的原始卵泡出現(xiàn)在卵巢表面上皮(OSE)內(nèi)，由卵原細(xì)胞和原始顆粒細(xì)胞聚集形成。該研究取成人卵巢表面上皮細(xì)胞在雌激素刺激物酚紅(PHR)存在的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)后觀察發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞直接分化為大的具有卵母細(xì)胞表型的細(xì)胞，可出現(xiàn)胚泡破裂并排出極體，表達(dá)透明帶蛋白，即具有次級卵泡的特征。而不含有PHR 的培養(yǎng)基內(nèi)，分化成顆粒型細(xì)胞。這表明OSE 可能是卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞潛在的來源。盡管與功能性的卵母細(xì)胞產(chǎn)生仍有一定距離，但是這個發(fā)現(xiàn)給生殖干細(xì)胞的存在提供了間接證據(jù)。也有人提出生殖干細(xì)胞的來源還有可能是骨髓及外周血。Johnson等［4］將骨髓移植至經(jīng)環(huán)磷酰胺和白消安處理后喪失了生殖細(xì)胞的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)接受了骨髓移植的小鼠卵巢中有卵泡生成，而對照組小鼠卵巢中則沒有或很少有卵泡生成。此外，將取自能表達(dá)GFP 轉(zhuǎn)基因雌性小鼠的外周血移植至經(jīng)過相同處理的小鼠體內(nèi)，在卵巢中發(fā)現(xiàn)了表達(dá)GFP 的卵母細(xì)胞。因此，他們認(rèn)為出生后的小鼠卵巢中存在卵母細(xì)胞和卵泡的更新。其來源可能是骨髓及外周血。盡管骨髓和外周血來源的細(xì)胞表現(xiàn)出了許多卵母細(xì)胞的特性，但是仍然不能夠明確是否這些卵母細(xì)胞能夠正常受精并發(fā)展成新的個體。

2 哺乳動物卵巢生殖干細(xì)胞存在的異議

盡管大量的實(shí)驗數(shù)據(jù)支持哺乳動物出生后存在卵泡更新，但并未得到女性生殖干細(xì)胞存在的確切證據(jù)。同時，對于上述卵巢生殖干細(xì)胞的質(zhì)疑也不斷出現(xiàn)。2006年，Eggan 等［5］針對Johnson 成年哺乳動物骨髓和外周血能導(dǎo)致新的卵母細(xì)胞形成的結(jié)論，將表達(dá)GFP 的轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型正常小鼠配對形成嵌合體小鼠。進(jìn)行嵌合的兩只小鼠共用一套循環(huán)系統(tǒng)。按照預(yù)期，在野生型小鼠卵巢內(nèi)應(yīng)有GFP 標(biāo)記的生殖細(xì)胞，在轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)應(yīng)有不表達(dá)GFP 的卵母細(xì)胞。然而，對嵌合體小鼠促排卵后獲得的卵母細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，來自轉(zhuǎn)基因小鼠的卵母細(xì)胞都只表達(dá)GFP，而來自野生型小鼠的卵母細(xì)胞沒有表達(dá)GFP。然后，將該種嵌合體小鼠中的野生型小鼠用環(huán)磷酰胺和白消安進(jìn)行不孕處理，之后收集到的卵母細(xì)胞也沒有GFP 陽性的表達(dá)。而在骨髓移植實(shí)驗中，移植的骨髓細(xì)胞也未能改善絕經(jīng)或化療導(dǎo)致的不育情況。因此，他們認(rèn)為成年動物的卵母細(xì)胞數(shù)目是固定的，也不能由循環(huán)的生殖干細(xì)胞更新生成。Eggan 等的研究結(jié)論也得到了一些學(xué)者的支持。2008年，Begum S 等［6］通過小鼠卵巢的移植實(shí)驗，將成年小鼠的卵巢移植到熒光免疫標(biāo)記的宿主動物的腎包膜或卵巢囊中，沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)綠色熒光的卵母細(xì)胞生成，卵泡的數(shù)量也沒有明顯增長。因此沒有證據(jù)表明有卵巢外的祖細(xì)胞植入卵巢內(nèi)，也沒有卵母細(xì)胞再生，因此他們與傳統(tǒng)觀點(diǎn)保持一致。但他同時認(rèn)為也不能排除成年小鼠卵巢中存在生殖干細(xì)胞的可能性。

Liu 等［7］通過對成年女性的卵巢中的生殖細(xì)胞進(jìn)行增殖和減數(shù)分裂的標(biāo)記基因(SCP3)表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果認(rèn)為不存在生殖細(xì)胞的更新或卵母細(xì)胞的生成，也沒有生殖干細(xì)胞的存在。

3 小鼠生殖干細(xì)胞的分離純化及后代的產(chǎn)生

當(dāng)人們對卵巢中生殖干細(xì)胞的存在及來源仍存在爭議的時候，國內(nèi)外的很多研究者已經(jīng)能夠從成年小鼠卵巢內(nèi)分離出罕見的具有有絲分裂活性的干細(xì)胞，并且在體外增殖培養(yǎng)數(shù)月后移植到不孕小鼠卵巢內(nèi)，但是這些細(xì)胞的功能及受精能力還沒有被確定［8-9］。2009年又有了新進(jìn)展，研究者從新生和成年小鼠卵巢中分離并建立了同時具有生殖細(xì)胞性和干細(xì)胞性，并且可以長期體外培養(yǎng)的生殖干細(xì)胞系［10］。該細(xì)胞系具有正常的核型及較高的端粒酶活性。該研究者通過酶消化及磁性分選法將小鼠卵巢中表達(dá)MVH(干細(xì)胞特殊性蛋白)的細(xì)胞分離出來，在摻入BrdU 的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。由于出生后小鼠卵巢中生殖細(xì)胞是不再進(jìn)行有絲分裂增殖的。BrdU 陽性表示細(xì)胞正在增殖，MVH 陽性表明該細(xì)胞屬于生殖干細(xì)胞，認(rèn)為MVH 和BrdU 都呈現(xiàn)陽性的細(xì)胞有可能是雌性GSCs。他們將這些呈現(xiàn)雙陽性的細(xì)胞從成年小鼠內(nèi)分離出來并建立細(xì)胞系，經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后仍為雙陽性。這些GSCs被GFP 標(biāo)記后移植到經(jīng)白消安處理后的不孕小鼠的卵巢中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞能夠產(chǎn)生卵子，并且能夠產(chǎn)生攜帶GFP 基因的后代。這一結(jié)果的發(fā)現(xiàn)，為卵子的產(chǎn)生及干細(xì)胞的自我更新做出了貢獻(xiàn)。該研究組報道發(fā)現(xiàn)了卵巢中生殖干細(xì)胞的存在，這些細(xì)胞具有相似于精原干細(xì)胞的一般特征，且定位于卵巢表面上皮層。2011年，該研究組又稱上次報道的MVH 磁珠分選和純化雌性GSCs 的效率低下，而通過采用生殖性特異表達(dá)蛋白Fragilis 進(jìn)行磁珠分選能大大提高雌性GSCs 純化的效率［11］。該研究組分離純化的細(xì)胞在未分化的狀態(tài)下表達(dá)干細(xì)胞多能性及生殖細(xì)胞的標(biāo)志物，例如堿性磷酸酶(AKP)、Oct4、Sox - 2 和SSEA - 1［12］。亦 有 研 究 者 從 果蠅［13］及青鳉魚［14］體內(nèi)證實(shí)了生殖干細(xì)胞的存在。

4 人類卵巢生殖干細(xì)胞的研究

目前人們已經(jīng)能從小鼠的卵巢中成功分離出雌性生殖干細(xì)胞并移植到不孕小鼠卵巢內(nèi)成功培育出了下一代。然而在人類的卵巢中是否也存在這樣的細(xì)胞并且也能夠通過移植產(chǎn)生新個體呢?2012年2月White 等［15］成功地從20 ～30 歲年輕女性的卵巢上皮組織中分離出卵母干細(xì)胞(oogonial stem cells，OSCs)。另外他們確定了一種敏感的分離方法:熒光激活細(xì)胞分類法(FACS)。這種方法的應(yīng)用可以從小鼠和人類卵巢中分離出罕見具有有絲分裂活性的細(xì)胞，與原始干細(xì)胞具有相似的基因表達(dá)。這種方法在體外的建立，可以成功分離生殖干細(xì)胞并在體外培養(yǎng)并擴(kuò)增，自發(fā)地產(chǎn)生35 ～59 μm 的卵母細(xì)胞，并通過所產(chǎn)生卵母細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)及單倍體狀態(tài)所鑒定。穩(wěn)定表達(dá)GFP 的生殖干細(xì)胞，被注入到生殖期女性的離體卵巢皮質(zhì)組織中，并將其移植到小鼠的卵巢中，發(fā)現(xiàn)在人類卵巢組織中產(chǎn)生了GFP 陽性的卵泡，因此年輕女性的卵巢類似于成年小鼠，具有產(chǎn)生有絲分裂活性的干細(xì)胞，能夠在體外繁殖并在體外和體內(nèi)產(chǎn)生卵母細(xì)胞。應(yīng)用這種異基因移植法的小鼠的卵巢組織雖然與正常人類生理環(huán)境不相同，但是由于倫理的限制，這仍是很多學(xué)者用于研究新生卵泡的較好的方法。該研究結(jié)果的發(fā)表立即引起廣泛的爭議。人們能達(dá)成共識的是成年哺乳動物卵巢中OSCs 的生物學(xué)角色和OSCs 自我更新和分化成卵母細(xì)胞的控制能力。

然而，既然體內(nèi)激活的卵母干細(xì)胞能夠更新卵泡池，為什么他們不能隨著年齡的增長維持卵巢功能［16］?事實(shí)上，卵巢老化是很多科學(xué)家在研究OSCs 和出生后卵子形成最重要的障礙，有研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)無卵子產(chǎn)生和絕經(jīng)后女性卵巢中OSE 干細(xì)胞具有體外分化成卵母細(xì)胞的能力［17］。然而，有研究表明35 ～40 歲女性，免疫系統(tǒng)的功能在逐漸下降，并伴隨著卵巢卵泡更新的下降［18］。Bukovsky 稱人類正常卵巢內(nèi)的生殖干細(xì)胞的生卵活性與兩個條件有關(guān):第一，在女性妊娠期或排卵前期，激素的水平應(yīng)該達(dá)到一定的條件，例如雌激素和LH/hCG 的循環(huán)高水平。然而，在滿足激素條件下，只有一部分卵母干細(xì)胞分化成了生殖細(xì)胞，這是因為沒有免疫系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞信號通路的存在［19-20］，即哺乳動物卵巢的免疫生理學(xué)［21］或卵巢內(nèi)穩(wěn)態(tài)的免疫調(diào)節(jié)［22］。通過對免疫系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞(T 細(xì)胞及單核細(xì)胞來源細(xì)胞MDC)的免疫組織化學(xué)分析，卵母干細(xì)胞分化成生殖細(xì)胞需要原始MDC 和活化的CD8+T細(xì)胞的參與，顆粒細(xì)胞的出現(xiàn)同樣需要活化的(HLA-DR)MDC［19，21］。然而，卵巢OSE 干細(xì)胞在體外產(chǎn)生卵子不需要這些免疫系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞參與。因此，只有當(dāng)合適的激素水平及免疫系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞活化的局部細(xì)胞信號同時出現(xiàn)時才能使OSCs 向生殖細(xì)胞分化。這些新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞與卵巢老化過程的相關(guān)性還需要更多的探討。

White 將從人類卵巢組織中分離出的卵母干細(xì)胞在體外培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只能產(chǎn)生初級卵母細(xì)胞，沒有發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂二期的卵母細(xì)胞產(chǎn)生。這是由于體外培養(yǎng)與人體自體卵巢組織的微環(huán)境的差別。沒有某些活化物質(zhì)的存在。而將卵母干細(xì)胞移植到人類卵巢組織中去培養(yǎng)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生原始卵泡、初級卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡等。如果能夠進(jìn)一步分化成減數(shù)分裂二期的卵子，將對未來的染色體的完整性，紡錘體的出現(xiàn)及發(fā)展能力都會有更大的幫助［15］。在未來的研究中，將試圖進(jìn)一步改進(jìn)體外培養(yǎng)基，使它可以更好的模擬正常人體卵巢內(nèi)環(huán)境?？梢愿玫姆只鲇猩衬芰Φ穆炎?，并期待能夠產(chǎn)生新的個體。

5 人類OSCs 未來的臨床應(yīng)用

對于人類OCSs 的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用還有許多尚待探索和開發(fā)的內(nèi)容，如果通過OCSs 的培養(yǎng)能夠成功分化出有生殖能力的卵子，那么將在未來產(chǎn)生多方面的臨床應(yīng)用:首先，人們可以進(jìn)行體外分離及培養(yǎng)OSCs，評估其在體外產(chǎn)生卵子的潛能［15］，并可以通過實(shí)驗系統(tǒng)揭示體外卵子產(chǎn)生中關(guān)鍵的信號通路。將激素及其他影響因素作用于OSCs 來觀察生卵能力，通過對影響因素的鑒定可以找到一種方法提高OSCs 生卵的活性。其次，有研究表明，將年輕女性的卵質(zhì)移植到反復(fù)IVF 失敗的患者的卵泡內(nèi)將提高其IVF 的成功率，但這種方法將使新生的個體中包含兩種不同來源的線粒體，攜帶兩種基因［23-24］，為了解決這個難題，人們設(shè)想出一個新的技術(shù)，名為“自體生殖細(xì)胞線粒體能量傳遞(AUGMENT)［25］”，它是將女性卵巢內(nèi)OSCs 自然產(chǎn)生的能量注入到同一個體卵子中以提高IVF 的成功率。這種自體OCS 來源的線粒體移植到ICSI 的人類卵母細(xì)胞的方法克服了現(xiàn)存線粒體因為老化及其他因素引起的負(fù)面影響。Cohen J 等［26］的研究已經(jīng)證實(shí)異體線粒體的移植可以提高IVF 的成功率，因此AUGMENT 應(yīng)該成為臨床上可考慮的方法，這仍需要更多的研究來支持。另外，OCSs 還有很多值得期待的應(yīng)用，例如，這些OCSs 將被冷凍保存以利于未來應(yīng)用于不孕、惡性腫瘤、干細(xì)胞基因移植等多種方面。分離純化后的人類OCSs 還可以作用于自身卵巢，提高體內(nèi)卵巢的儲備功能的規(guī)模。盡管最近的研究已經(jīng)證實(shí)異基因移植的方法可以使人類卵母細(xì)胞形成，但是任何的臨床應(yīng)用還需要更確切的依據(jù)的提出，這些OSCs 可能的臨床應(yīng)用雖然只是暢想，但未來經(jīng)過我們更多更全面的研究和探索，這些臨床價值終將呈現(xiàn)。

6 小 結(jié)

在對哺乳動物卵巢出生后是否存在生殖干細(xì)胞這個問題的大量研究中，許多干細(xì)胞實(shí)驗被譽(yù)為重大突破。相關(guān)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)在小鼠中報道，目前更重要的是人類中的新發(fā)現(xiàn)。盡管在臨床應(yīng)用上還有許多難以操作和理論上的障礙，能夠確定的是，這個工作有很大的潛力去改變不孕癥治療的未來。提高OSCs 的分離和轉(zhuǎn)變成卵母細(xì)胞的效率還需要更多的研究。更多的基因完整性和卵母細(xì)胞質(zhì)量標(biāo)記物還需要更多詳細(xì)的描述。但相信由于該研究所具有的重大意義，新的進(jìn)展必將會不斷出現(xiàn)。

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