阿司匹林對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞腸分化標(biāo)志物表達(dá)的影響

朱 蓉，李伶俐，李仕宇，陳小燕，趙 逵

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 遵義 563000

結(jié)腸癌是常見的腸道惡性腫瘤，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，多數(shù)是由正常結(jié)腸黏膜上皮異常增生至腺瘤，最終至癌變這一逐步遞進(jìn)的“經(jīng)典”過程所致，在此過程中發(fā)生了一系列的基因改變。近年來，大量學(xué)者認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞才是結(jié)腸癌的“根源”細(xì)胞，對結(jié)腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)耐藥過程起決定性作用。當(dāng)結(jié)腸癌干細(xì)胞不再自我復(fù)制和更新，而發(fā)生分化成熟時，結(jié)腸癌將走向消退；相反，若出現(xiàn)異常分化、過度增殖，將促進(jìn)癌的發(fā)生、發(fā)展。Bao等［1］研究發(fā)現(xiàn)，杯狀細(xì)胞分化標(biāo)志物黏蛋白2(mucin 2，MUC2)的基因敲除小鼠會發(fā)生結(jié)腸癌。魯明良等［2］研究也表明，黏蛋白1(mucin1，MUC1)的表達(dá)上調(diào)或MUC2的表達(dá)下調(diào)可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移。阿司匹林作為臨床上常用的非甾體抗炎藥，研究表明，長期應(yīng)用能降低患結(jié)腸癌的風(fēng)險，預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生［3-4］。但具體作用機(jī)制不完全清楚，主要與抑制腸道炎性反應(yīng)相關(guān)，而關(guān)于阿司匹林對腫瘤細(xì)胞分化方面的研究鮮有報道［5］。本研究以腸分化標(biāo)志物MUC2、三葉因子3(trefoil factor 3，TFF3)、蔗糖酶-異麥芽糖酶(sucroseisomaltase)和溶菌酶(lysozyme)作為研究目標(biāo)分子，觀察阿司匹林干預(yù)對以上腸分化標(biāo)志物表達(dá)的影響，旨在探討阿司匹林對結(jié)腸癌細(xì)胞分化的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，阿司匹林購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)擴(kuò)增試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，MUC2、TFF3、lysozyme、sucraseisomaltase和β-actin引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，MUC2、TFF3和lysozyme單克隆一抗購自美國Abcam公司，sucrase-isomaltase單克隆一抗購自美國Santa Cruz公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購自基因科技(上海)股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中恒溫培養(yǎng)，細(xì)胞處于對數(shù)生長期時用于實驗。

1.3 活細(xì)胞計數(shù)試劑盒CCK-8檢測藥物對細(xì)胞增殖的改變

HT-29細(xì)胞常規(guī)消化吹散后調(diào)整細(xì)胞數(shù)目1×104個/孔，接種于96孔板內(nèi)，空白組不含細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行分組加藥，加入阿司匹林終濃度分別為0(對照組)、1.5、2.5、5.0、10.0和15.0 mmol/L，每個濃度5個復(fù)孔，再培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，溫育4 h，予酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度(D)值，實驗重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞的增殖抑制率=(1-實驗組D值/對照組D值)×100%；計算阿司匹林干預(yù)48 h的IC50進(jìn)行進(jìn)一步的實驗。

1.4 RTFQ-PCR檢測阿司匹林對HT-29細(xì)胞4種腸分化標(biāo)志物mRNA表達(dá)的改變

細(xì)胞計數(shù)調(diào)整密度2×105/mL在培養(yǎng)瓶中接種培養(yǎng)。實驗分為對照組及阿司匹林組，培養(yǎng)24、48和72 h后，按TRIzol使用說明書提取總RNA，于紫外分光光度儀測定總RNA的純度和濃度；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL；從GenBank查出相關(guān)基因，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)；以cDNA為模板，按擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，擴(kuò)增體系20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95℃ 15 s，60 ℃30 s，65 ℃ 10 s，共36個循環(huán)；采用相對定量法(2－ΔΔCt法)計算mRNA的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)至少3次。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測藥物對HT-29細(xì)胞分化標(biāo)志物MUC2蛋白表達(dá)的改變

取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞常規(guī)消化后爬片培養(yǎng)；實驗設(shè)對照組及阿司匹林組，培養(yǎng)48 h后，取出固定，按照S-P法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，加入兔抗人MUC2單克隆抗體(1∶100)，封片后采用顯微鏡觀察，分析測算結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

表1 RTFQ-PCR引物對Tab. 1 Primer pairs used in RTFQ-PCR

1.6 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測藥物對HT-29細(xì)胞分化標(biāo)志物sucrase-isomaltase和lysozyme蛋白表達(dá)的改變

取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞，培養(yǎng)及分組同RTFQ-PCR實驗，收集細(xì)胞標(biāo)本，提取總蛋白，按照BCA法進(jìn)行蛋白定量，隨后進(jìn)行配膠，上樣，電泳，制作“三明治”結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗，洗滌，加二抗，洗滌，發(fā)光，最后以全自動凝膠成像分析系統(tǒng)掃描、分析結(jié)果。實驗重復(fù)至少3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均為計量資料，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 1 阿司匹林抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株增殖(x±s)Fig. 1 Aspirin inhibits proliferation of human colon cancer cell line HT-29

2 結(jié) 果

2.1 阿司匹林抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株增殖

CCK-8檢測結(jié)果顯示，阿司匹林抑制HT-29細(xì)胞增殖，且呈量效性和時效性(圖1)；經(jīng)計算得出阿司匹林干預(yù)48 h的IC50為4.865 mmol/L。

2.2 阿司匹林對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株腸分化標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響

RTFQ-PCR結(jié)果顯示，阿司匹林IC50作用于HT-29細(xì)胞24、48和72 h，與對照組比較，腸杯狀細(xì)胞分化標(biāo)志物MUC2和TFF3的mRNA相對表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，作用48、72 h時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(MUC2：P=0.004，P=0.000；TFF3：P=0.046，P=0.000)；腸潘氏細(xì)胞分化標(biāo)志物lysozyme的mRNA相對表達(dá)量逐漸下調(diào)，與對照組比較，作用24、48和72 h時差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.036、0.001和0.000)；腸吸收細(xì)胞分化標(biāo)志物sucrase-isomaltase的mRNA相對表達(dá)量較對照組也逐漸下調(diào)，作用48、72 h時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007、0.000，圖2)。

2.3 阿司匹林上調(diào)HT-29細(xì)胞分化標(biāo)志物MUC2蛋白的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，阿司匹林干預(yù)48 h，腸杯狀細(xì)胞標(biāo)志物MUC2蛋白表達(dá)明顯增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001，圖3)。

圖 2 阿司匹林對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株分化標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響Fig. 2 Effects of aspirin on the mRNA expressions of intestinal differentiation markers in colon cancer cell line HT-29

2.4 阿司匹林對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株腸潘氏細(xì)胞分化標(biāo)志物lysozyme和腸吸收細(xì)胞分化標(biāo)志物sucrase-isomaltase蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，阿司匹林干預(yù)24、48和72 h時，與對照組比較，lysozyme的蛋白表達(dá)逐漸減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028、0.000和0.000)；Sucrase-isomaltase蛋白表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)，干預(yù)48、72 h時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011、0.000，圖4)

圖 3 阿司匹林上調(diào)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株MUC2的蛋白表達(dá)Fig. 3 Aspirin up-regulated the protein expression of MUC2 in colon cancer cell line HT-29

圖 4 阿司匹林下調(diào)HT-29細(xì)胞lysozyme和sucrase-isomaltase蛋白的表達(dá)Fig. 4 Aspirin down-regulated the protein expressions of lysozyme and sucrase-isomaltase in colon cancer cell line HT-29

3 討 論

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，是導(dǎo)致人類死亡的重要原因。目前，對中晚期結(jié)腸癌的治療及如何解決治療后的復(fù)發(fā)仍是世界性難題。結(jié)腸癌病因復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境及飲食等多個方面，其發(fā)病機(jī)制目前仍不完全明確。近年來，許多學(xué)者提出作為腫瘤“種子”的腫瘤干細(xì)胞才是結(jié)腸癌的最終“源頭”，對結(jié)腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)耐藥等過程起決定作用［6］。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、無限增殖、多向分化、高致瘤和強(qiáng)耐藥等“干性”特點(diǎn)。只有當(dāng)結(jié)腸癌干細(xì)胞不再自我復(fù)制和更新，而發(fā)生分化走向成熟時，結(jié)腸癌才將走向消退；相反，若出現(xiàn)異常分化、過度增殖，將促進(jìn)癌的發(fā)生、發(fā)展。因此，研究腫瘤細(xì)胞的分化具有重要意義。

正常成體腸干細(xì)胞最終分化為杯狀細(xì)胞、吸收細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞等終末細(xì)胞表型。這些細(xì)胞不斷地分化成熟并凋亡，維持腸上皮的更新穩(wěn)態(tài)，而不至于異常增殖發(fā)生腫瘤。不同類型的分化成熟細(xì)胞，具有不同的表型特征，分泌和表達(dá)不同的標(biāo)志物，其功能也不同。

MUC2和TFF3是腸杯狀細(xì)胞分泌的標(biāo)志物，其中MUC2是一種相對分子質(zhì)量較大的分泌型黏蛋白，生理狀態(tài)下，在腸道黏膜上皮細(xì)胞中100%表達(dá)，其主要存在于杯狀細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，對腸道起潤滑及保護(hù)作用。有研究證實，MUC2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)減少，甚至在結(jié)腸腺瘤中表達(dá)也有下調(diào)［7-8］。TFF3是由杯狀細(xì)胞分泌的多肽物質(zhì)，對腸道上皮也有保護(hù)功能，且在腸道黏膜的損傷修復(fù)中起重要作用。John等［9］研究發(fā)現(xiàn)，TFF3在結(jié)腸炎性組織、腺瘤性息肉及結(jié)腸癌組織中的表達(dá)逐漸降低，與腫瘤細(xì)胞的增殖負(fù)相關(guān)，但也有研究得出相反的結(jié)論［10］。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株中存在MUC2和TFF3的表達(dá)，且在阿司匹林干預(yù)后表達(dá)增加。

Sucrase-isomaltase正常時僅在成人小腸吸收細(xì)胞的刷狀緣及胎兒結(jié)腸中表達(dá)，在成人結(jié)腸中沒有表達(dá)［11］。但很早就有研究發(fā)現(xiàn)，sucrose-isomaltase在HT-29、Caco2結(jié)腸癌細(xì)胞株及結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，并且其表達(dá)升高與結(jié)腸癌患者死亡風(fēng)險增加有關(guān)［12-13］。本研究結(jié)果也證實，sucrase-isomaltase在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中高表達(dá)，且阿司匹林干預(yù)后表達(dá)明顯降低，說明阿司匹林干預(yù)防治結(jié)腸癌有效可能也與該酶相關(guān)。

Lysozyme一般由小腸Paneth細(xì)胞分泌，具有天然抗菌作用。正常情況下結(jié)腸黏膜無Paneth細(xì)胞存在，因此沒有l(wèi)ysozyme分泌。但有研究提出，在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中，可能因Paneth細(xì)胞化生，從而導(dǎo)致結(jié)腸癌組織lysozyme的表達(dá)明顯增多［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株中存在lysozyme高表達(dá)，且阿司匹林干預(yù)后表達(dá)明顯降低。

阿司匹林是一種非常古老的非甾體抗炎藥，具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎抗風(fēng)濕和抑制血小板聚集等作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小劑量長期使用還具有防治一些腫瘤的作用，包括結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌等［15-16］。大量流行病學(xué)和實驗室研究均表明，阿司匹林等非甾體抗炎藥能抑制甚至逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌癌前病變［3］，能明顯降低結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率［4］。我們的前期實驗［17］及本次實驗結(jié)果也證實，阿司匹林可以抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖，并且呈時間和劑量依賴性。

阿司匹林等非甾體抗炎藥防治結(jié)腸癌機(jī)制復(fù)雜，主要通過COX-2和非COX-2兩大途徑發(fā)揮作用，具體包括：抑制COX-2表達(dá)、促進(jìn)15-PGDH表達(dá)，抑制前列腺素合成，抑制Wnt/β-catenin信號通路，抑制細(xì)胞內(nèi)DNA的合成；抑制細(xì)胞周期；抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，增強(qiáng)免疫，抑制血管生成和抗氧化作用等［18-19］。近年來隨著結(jié)腸癌干細(xì)胞理論的提出和發(fā)展，有學(xué)者認(rèn)為，阿司匹林等非甾體抗炎藥防治結(jié)腸癌最終通過對結(jié)腸癌干細(xì)胞的調(diào)控而實現(xiàn)［20］。而當(dāng)結(jié)腸癌干細(xì)胞分化成熟時，結(jié)腸癌將不再進(jìn)展、甚至消退。因此我們設(shè)想，阿司匹林防治結(jié)腸癌有效，可能通過促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞分化而實現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，阿司匹林干預(yù)后，腸杯狀細(xì)胞分化標(biāo)志物MUC2、TFF3表達(dá)上調(diào)，腸吸收細(xì)胞標(biāo)志物sucroseisomaltase和Paneth細(xì)胞標(biāo)志物lysozyme的mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)，說明阿司匹林干預(yù)后，結(jié)腸癌細(xì)胞向杯狀細(xì)胞表型分化成熟，而可能并不向吸收細(xì)胞和潘氏細(xì)胞表型分化。

總之，本研究作為初探發(fā)現(xiàn)，阿司匹林對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞細(xì)胞株分化具有重要影響，但是其促進(jìn)HT-29細(xì)胞向杯狀細(xì)胞分化具體機(jī)制如何，其對真正的結(jié)腸癌干細(xì)胞的分化影響又如何，以及對人類結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌細(xì)胞分化如何影響，均尚待進(jìn)一步研究。

［1］ BAO Y H, GUO Y C, LI Z X, et al. MicroRNA profiling in Muc2 knockout mice of colitis-associated cancer model reveals epigenetic alterations during chronic colitis malignant transformation［J］. PLoS One, 2014, 9(6): e99132.

［2］ 魯明良, 何 瑾, 葉衛(wèi)東. MUCl聯(lián)合MUC2在結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌中聯(lián)合表達(dá)與臨床病理的相關(guān)性研究［J］. 結(jié)直腸肛門外科, 2014, 20(3): 158-163.

［3］ DREW D A, CHIN S M, GILPIN K K, et al. ASPirin Intervention for the REDuction of colorectal cancer risk(ASPIRED): a study protocol for a randomized controlled trial［J］. Chan Trials, 2017, 18(1): 50.

［4］ 童 朵, 張 文. 阿司匹林與大腸癌防治及其相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 中國癌癥雜志, 2016, 26(9): 795-800.

［5］ RICCHI P, PIGNATA S, DIPOPOLO A, et al. EFFECT of aspirin on cell proliferation and differentiation of colon adenocarcinoma Caco-2 cells［J］. Int. J. Cancer, 1997,73(6): 880-884.

［6］ SAVAGE P. Chemotherapy curable malignancies and cancer stem cells: a biological review and hypothesis［J］. BMC Cancer, 2016, 16(1): 906.

［7］ 左曉旭, 朱襲嘉, 李盛國, 等. 黏蛋白2在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其相關(guān)臨床意義的研究［J］. 中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新, 2015,12(29): 12-14.

［8］ 馬曉娟, 孟高克, 胡建國, 等. MUC2 在結(jié)腸癌及結(jié)腸腺瘤的表達(dá)及意義［J］. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2015, 37(5): 524-526, 605.

［9］ JOHN R, EI-ROUBY N M, TOMASETTO C, et al. Expression of TFF3 during multistep colon carcinogenesis［J］. Histol Histopathol, 2007, 22(7): 743-751.

［10］ 李鳳玉, 呂 洋, 劉 博, 等. 腸三葉因子與Wnt/β-Catenin信號通路在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系［J］. 中國老年學(xué)雜志，2015, 35(22): 6441-6444.

［11］ RODRIGUEZ D, RAMSAY A J, QUESADA V, et al.Functional analysis of sucrase-isomaltase mutations from chronic lymphocytic leukemia patients［J］. Human Molecular Genetics, 2013, 22(11): 2273-2282.

［12］ ZWEIBAUM A, TRIADOU N, KEDINGER M, et al. Sucraseisomaltase: a marker of foetal and malignant epithelial cells of the human colon［J］. Int J Cancer, 1983, 32(4): 407-412.

［13］ JESSUP J M, LAVIN P T, ANDREWS C W, et al. Sucraseisomaltase is an independent prognostic marker for colorectal carcinoma［J］. Diseases of the Colon and Rectum, 1995,38(12): 1257-1264.

［14］ OSBORNE C L E, KHAN A, OGUNBIYI O, et al. Metalplastic paneth cells in ulcerative colotis and colorectal cancer［J］.Gut, 2003, 52(Suppl1): A62.

［15］ VIDAL A C, FREEDLAND S J. Aspirin and prostate cancer prevention［J］. Aging (Albany NY), 2015, 7(5): 292-293.

［16］ BARDIA A, KEENAN T E, EBBERT J O, et al. Personalizing aspirin use for targeted breast cancer chemoprevention among postmenopausal women［J］. Mayo Clin Proc, 2016, 91(1):71-80.

［17］ 朱 蓉, 趙 逵, 方興國等. 丙谷胺、阿司匹林對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用［J］. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013, 36(6): 536-541.

［18］ EGASHIRA I, TAKAHASHI-YANAGA F, NISHIDA R, et al.Celecoxib and 2,5-dimethylcelecoxib inhibit intestinal cancer growth by suppressing the Wnt/β-catenin signaling pathway［J］. Cancer Sci, 2017, 108(1): 108-115.

［19］ YANG H B , YIN P , SHI Z, et al. Sinomenine, a COX-2 inhibitor, induces cell cycle arrest and inhibits growth of human colon carcinoma cells in vitro and in vivo［J］. Oncol Lett, 2016, 11(1): 411-418.

［20］ MOON C M, KWON J H, KIN J S, et al. Nonsteroidal antiinflammatory drugs suppress cancer stem cells via inhibiting PTGS2 (cyclooxygenase 2) and NOTCH/HES1 and activating PPARG in colorectal cancer［J］. Int J Cancer, 2014, 134(3):519-529.