氧化苦參堿對病毒性心肌炎小鼠的作用研究*

史艷平，汪 瓊,李 丹，豆玉鳳，李小青

西安市兒童醫(yī)院(西安 710003)

病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VM)是一類由嗜心肌病毒感染引起的非缺血性心臟疾病，其主要表現(xiàn)為心肌的非特異性間質性炎癥及心肌細胞的變性壞死，是循環(huán)系統(tǒng)的常見病，兒童尤為多見。目前國內報道其發(fā)病率為1.827/萬，患病率為2.183/萬[1]，且呈逐年上升的趨勢。本病嚴重影響著人類的身體健康，但其發(fā)病機制至今尚未明確，治療也缺乏特異性，主要為對癥治療。重者可出現(xiàn)嚴重心律失常、心源性休克、心衰甚至猝死，輕者可無自覺癥狀，部分可轉為慢性，呈現(xiàn)心臟進行性增大、心功能下降、心律失常等，嚴重影響著患兒的生存質量。目前可應用的治療手段極為有限。近年來相關于中醫(yī)中藥治療本病的研究報道不斷，尤其是中藥提取物氧化苦參堿(Oxymatrine，OMT)在心血管系統(tǒng)疾病治療中的顯著療效，促使了不少人開始研究其與本病治療的內在聯(lián)系。本文就氧化苦參堿對病毒性心肌炎小鼠的的作用進行研究，以期為OMT在本病的治療使用提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1 病 毒 柯薩奇病毒B3(CVB3)，Nancy株，在Hela細胞中傳代，凍融離心3次，分裝上清液，-70℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實驗動物 選取60只雄性4周齡 Balb/c 小鼠(15g左右)。

3 動物模型制備及給藥 共計小鼠60只，隨機分為空白、對照、高劑量、低劑量4組，每組各15只。空白小鼠腹腔接種病毒培養(yǎng)液0.1 ml，余3組腹腔接種0.1 ml CVB3的病毒液，連用7 d，第8天開始OMT灌胃，劑量分別為高劑量0.1mg/(kg·d)；低劑量0.025 mg/(kg·d)，1次/d，持續(xù)10 d。每日觀察每組小鼠存活數(shù)。17 d后，無痛法處死各組小鼠，留取心臟組織，測定心臟與體重比值，另外用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋作病理學檢查。

4 生存率實驗 60只小鼠用作生存率分析，根據(jù)前面所述方法造模及給藥治療。連續(xù)觀察17 d，每日統(tǒng)計小鼠生存數(shù)目，計算感染后17 d小鼠生存率。

5 病理組織學檢查 將石蠟包埋組織切片，常規(guī)蘇木素-伊紅( H-E) 染色，光學顯微鏡下觀察心肌病理，以每張切片均取高倍視野5 個，計算出每個視野中壞死區(qū)域及炎性細胞浸潤與整個視野面積之比值，計算出心肌病變積分，> 75%計4分，～75%計3 分，～50%計2分，< 25%計1分，無病變計0分。

結 果

1 各組小鼠死亡率 在小鼠生存率實驗過程中，空白組小鼠無死亡，對照組于第6天開始出現(xiàn)死亡，共死亡8只，生存率為46.7%，高劑量組于病毒感染后第7天開始出現(xiàn)死亡， 共死亡3只，生存率為80%；低劑量組于病毒感染后第6天開始出現(xiàn)死亡，共死亡5只，生存率為66.7%；高劑量及低劑量組小鼠的17 d 生存率明顯高于對照組(P<0.05)。

2 小鼠心臟/體重比值和心肌組織病理學結果 結果顯示，低劑量、高劑量與對照組在小鼠心臟/體重比值有差異性(P<0.05)。低劑量、高劑量組與對照組相比，心肌壞死程度及炎癥細胞浸潤的積分具有差異性(P<0.05)。

2.1 高劑量組及低劑量組小鼠心臟/體重比值明顯低于模型組(P<0.05) ,見表1。

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 小鼠心肌組織蘇木精-伊紅染色結果顯示，低劑量組、高劑量組小鼠心肌壞死組織面積語總面積比值明顯低于對照組(P<0.05,圖1)。低劑量組、高劑量組小鼠心肌炎癥細胞浸潤與總面積比值明顯低于對照組(P<0.05，圖1)。

心肌病理組織學檢查：對照組見大量心肌細胞壞死崩解，細胞及胞核的輪廓消失，周圍有大量炎性細胞浸潤，間質有較多膠原纖維，低劑量與高劑量組以上病變減輕，高劑量組好轉最為顯著，僅有少量炎性細胞浸潤和壞死灶，空白組心肌胞漿著色均勻，排列規(guī)則，未見炎性細胞浸潤，見圖1。

圖1 心肌病理組織學檢查

討 論

VM的發(fā)病機制至今尚未完全闡明，現(xiàn)代研究表明，VM的早期以及暴發(fā)型VM的發(fā)生與病毒直接感染侵犯心臟相關，在慢性期的反應與病毒持續(xù)存在，不能清除以及自身的免疫反應相關。病理學研究表明，急性期的變化表現(xiàn)為心肌細胞壞死變性、單核及淋巴細胞等炎性細胞浸潤，而在慢性期則多表現(xiàn)為膠原纖維增生，纖維細胞增多，而兩者在發(fā)病機理與病理表現(xiàn)往往相互交叉[2]。

治療上，目前西醫(yī)治療包括一般治療和對癥治療。一般治療指臥床休息，進食富含維生素、蛋白質的容易消化食品。對癥治療包括抗病毒治療：臨床多應用利巴韋林抗病毒，但目前還沒有抗病毒藥物治療病毒性心肌炎有效的證據(jù)。激素及免疫抑制劑在本病中的治療效果尚未得到肯定，目前的研究不能表明激素及免疫抑制類藥物可以減輕或緩解病情并且降低病死率[3]。近年來中藥治療病毒性心肌炎報道較多，但大多數(shù)研究停留在臨床療效研究，而基礎實驗研究較少。一項研究較為系統(tǒng)地評價了二十多種中藥，結果發(fā)現(xiàn)僅有三種中藥對于本病有著較為肯定的作用。復方丹參注射液可以改善心律失常、降低LDH水平；黃芪能夠減輕心律失常、改善心功能，降低CPK；參麥注射液能夠顯著改善心功能，降低心肌酶[2]。

苦參為豆科槐屬植物,始載于《本經(jīng)》?！侗窘?jīng)》云：“味苦、性寒?！薄爸餍母菇Y氣，癥瘕積聚，黃疽，溺有余瀝，逐水，陰癰腫，補中，明目止淚，歸心、胃、大腸、肝、膀胱經(jīng)?！毙晕犊嗪?有清熱燥濕,祛風殺蟲,利尿之功效。其成分包括苦參堿、氧化苦參堿等生物堿，苦參丁醇、苦參醇等黃酮成分,另含有機酸類，糖類,氨基酸類,揮發(fā)油類等多種成分[4]。OMT是苦參的主要有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗心律失常、抗纖維化等廣泛的藥理作用[5]。臨床上已有不少研究從這幾方面探討過OMT治療VM的療效與機制，多認為是通過抗VM病毒[6]，抗心肌纖維化[7]，抗心律失常[8]以及缺血灌注損傷的保護[9]幾個方面來發(fā)揮作用。其抗炎作用，已有人在臨床及實驗中證實，如韓運洋[10]等人通過給采用角叉菜膠(Carrageenin)、二甲苯(Xylene)和冰醋酸(Acetic acid)制作的動物炎癥模型灌胃不同劑量的OMT，同時測量抗炎指標，發(fā)現(xiàn)OMT可減少小鼠扭體次數(shù)及足部、耳廓的腫脹度，表明OMT具有良好的抗炎作用。錢利武[11]通過動物模型發(fā)現(xiàn)OMT具有良好的鎮(zhèn)痛抗炎活性，能明顯抑制小鼠腹腔毛細血管通透性。

孫永梅等[12]通過實驗證明OMT具有很好的抗CVB3的作用，對于被CVB3感染的新生大鼠的心肌細胞可以產生很好的保護作用。心肌纖維化也是VMC慢性病理的特征。方艷妮等[13]應用慢性心肌炎小鼠模型，觀察OMT及卡托普利對抗心肌肌球蛋白抗體表達的影響。結果顯示OMT的副作用更小，且具有與卡托普利同樣干預慢性VMC小鼠抗心肌肌球蛋白的表達、具有保護心肌、抑制膠原、防止心臟重構的作用。有學者研究表明OMT可能是通過抑制p38MAPK磷酸化來抑制醛固酮所誘導的心肌成纖維細胞增殖而達到抗纖維化的作用[14]。

本研究表明VM小鼠在應用OMT后，存活率較對照組明顯升高(P<0.05)，心肌病變( 炎性浸潤及壞死) 積分顯著下降(P<0.05)，且與OMT劑量呈正比，這表明OMT可以明顯改善病毒性心肌炎的炎性改變和損傷。因此，我們認為OMT不僅對VM慢性期心肌細胞的纖維化有改善作用，對早期的炎癥損傷也有很好的抑制作用。這對我們臨床應用OMT治療VM進一步提供了有力的依據(jù)，也提示我們早期使用OMT對VM進行干預是有效的。但OMT的作用廣泛，其是否存在其他路徑共同作用于VM，以及其產生作用的內在機制靶點尚待我們進一步研究。

[1] 馬 融，胡思源.兒科疾病中醫(yī)藥臨床研究技術要點[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2012：163.

[2] 陳懷生,溫雋珉,吳勝楠.病毒性心肌炎的臨床診治及相關問題[J].中國實用內科雜志,2008,28(6)：510-512.

[3] Chen HS，Yang M，Liu J. Corticosteroids for viral myocarditis[J]. Cochrane Database of Systematic Reviews，2006，4:4471.

[4] Lai JP，He XW ，Jiang Y，etal. Preparative separation and determination of matrine from the Chinese medicinal plant Sophora flavescens Ait by molecularly imprinted solid-phase extraction[J]. Anal Bioanal Chem,2003,375(2):264.

[5] 胡會平,劉建慧,孫 鑫,等. 苦參堿及衍生物的生物活性和合成研究進展[J]. 魯東大學學報：自然科學版,2015,33(4):339-345.

[6] 胡月琴,王燕燕. 苦參堿抗感染作用研究進展[J]. 安徽醫(yī)藥,2016,11(7):1229-1232.

[7] 付凌云,黃海烽,徐旖旎,等. 氧化苦參堿抑制p38MAPK磷酸化改善醛固酮誘導心肌成纖維細胞增殖[J]. 中國實驗方劑學雜志,2015,23(22):103-107.

[8] Runtao G.Oxymatrine,the main alkaloid compenent of Sophoraroots,protects heart against arrhythmias in rats[J].Planta Med,2011,77(3):226-230.

[9] 蔣 瑩,李 輝. 氧化苦參堿預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用及其機制研究[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2015,11(17):12-13.

[10] 韓運洋,李 雪,張艷麗. 氧化苦參堿體內抗炎作用的實驗研究[J]. 輕工科技,2016,34(9):33-34+38.

[11] 錢利武,戴五好,周國勤,等. 苦參及山豆根主要生物堿鎮(zhèn)痛抗炎作用研究[J]. 中成藥,2012,40(8):1593-1596.

[12] 孫永梅,初桂蘭,陳 霞,等. 苦參堿對柯薩奇B-3型病毒感染心肌細胞的保護作用及其與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路的關系[J]. 實用兒科臨床雜志,2010,25(18):1428-1431.

[13] 方艷妮,郭春艷,汪 翼.氧化苦參堿對慢性病毒性心肌炎小鼠心肌的保護作用[J].實用兒科雜志,2010,25(1)：25-27.

[14] 付凌云,黃海烽,徐旖旎，等. 氧化苦參堿抑制p38MAPK磷酸化改善醛固酮誘導心肌成纖維細胞增殖[J]. 中國實驗方劑學雜志,2015,21(22):103-107.