數(shù)據(jù)分析應(yīng)用于中藥譜效關(guān)系中的研究進(jìn)展

潘杰,劉德勝，顏貴明

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

傳統(tǒng)中藥方劑常常是多種中藥配伍而成，具有成分復(fù)雜、不明確和藥理作用機(jī)制不明等特點(diǎn)。這些特點(diǎn)使得中藥藥效飽受爭(zhēng)議，難以在國(guó)際上進(jìn)一步推廣。近年來，中藥學(xué)研究者們致力于中藥藥理藥效的研究。大部分研究集中在通過對(duì)藥材的有效成分進(jìn)行提取和分離得到單個(gè)有效成分，如人參皂苷[1]和青蒿素[2]等，再對(duì)提取出來的單個(gè)有效成分進(jìn)行藥理和藥效學(xué)研究。雖然這樣的研究克服了中藥方劑成分復(fù)雜的問題，并且在一定程度上解釋了單個(gè)有效成分的藥理學(xué)活性及作用機(jī)制，但是其作用療效相對(duì)于原本的中藥方劑卻大打折扣，即使在劑量加倍的條件下，其作用效果依舊不佳。于是越來越多的研究者提出不同藥理機(jī)制已明確的有效成分之間是否可以協(xié)同作用的概念。中藥譜效關(guān)系已經(jīng)被廣泛地運(yùn)用到了中藥藥效研究、藥物配伍、炮制工藝改良和藥效預(yù)測(cè)等領(lǐng)域[3-4]。該方法是指將已獲得的中藥指紋圖譜與中藥的藥理藥效學(xué)研究成果，通過各種生物信息學(xué)方法，建立兩者的線性或非線性相關(guān)關(guān)系，最終得到“譜-效”映射關(guān)系，用于預(yù)測(cè)單味藥物或中藥復(fù)方制劑的藥效和藥理機(jī)制[5]。不可否認(rèn)的是，數(shù)據(jù)分析在“譜-效”建模過程中發(fā)揮了重要的作用。而數(shù)據(jù)分析手段的科學(xué)性和合理性影響著“譜-效”建模的準(zhǔn)確性和有效性。近年來，隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的來臨，越來越多譜效分析研究開始出現(xiàn)，對(duì)不同的數(shù)據(jù)分析算法的了解和選擇決定了最終“譜-效”建模的有效性。本文將就近十幾年以來的譜效分析的數(shù)據(jù)分析算法進(jìn)行綜述，使讀者能充分認(rèn)識(shí)這些數(shù)學(xué)建模方法，擇優(yōu)選擇。

1 有效成分與藥效的關(guān)聯(lián)度預(yù)測(cè)

對(duì)各有效成分與藥效之間的相關(guān)性預(yù)測(cè)可采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、灰關(guān)聯(lián)度分析和相關(guān)分析等方法，這些數(shù)據(jù)分析方法可以建立中藥圖譜與藥物有效性的關(guān)系，為中藥藥效預(yù)測(cè)提供可能。

1.1 灰關(guān)聯(lián)度分析(grey relational analysis，GRA)

關(guān)聯(lián)度是指兩個(gè)變量的隨時(shí)間或其他的實(shí)驗(yàn)條件的變化趨勢(shì)的相關(guān)性，若兩個(gè)變量的同向變化趨勢(shì)程度高，則兩個(gè)變量的關(guān)聯(lián)度高，反之則關(guān)聯(lián)度低?；谊P(guān)聯(lián)度分析即通過度量變量的發(fā)展趨勢(shì)的相同或相異程度，來衡量相關(guān)性。這類相關(guān)分析是對(duì)單一觀察對(duì)象表現(xiàn)現(xiàn)象的表觀評(píng)估，這些具有關(guān)聯(lián)性的變量其本質(zhì)上常常是互相影響，具有因果關(guān)系、協(xié)同關(guān)系或者是拮抗關(guān)系的。通過相關(guān)關(guān)系在一定程度上可以預(yù)估變量?jī)?nèi)部本質(zhì)的互作關(guān)系?；谊P(guān)聯(lián)度分析用于樣本的信息量單一，影響因素復(fù)雜的圖譜，可以客觀地體現(xiàn)各成分間的影響和互作。其基本分析步驟為:①分析中藥圖譜，仔細(xì)對(duì)比獲得共有峰，用相應(yīng)的藥效學(xué)參數(shù)指標(biāo)來作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，無量綱化處理參考數(shù)列和比較數(shù)列，消除不同計(jì)量單位引起的差異;②計(jì)算得到藥效指標(biāo)和共有峰之間的絕對(duì)差值;③計(jì)算得到藥效指標(biāo)與每個(gè)特征峰間的關(guān)聯(lián)系數(shù)，以平均值法求得關(guān)聯(lián)度[6]。如果兩個(gè)研究變量在隨實(shí)驗(yàn)加載條件變化而變化過程中的一致性程度較高，那么就定義為兩者關(guān)聯(lián)度比較大，相反，變化一致程度低則兩者關(guān)聯(lián)度小。梁建欽等[7]從芒果葉中利用不同極性溶劑提取到了有效物，已知這些提取物的抗炎特性差異很大，通過 HPLC 法建立指紋圖譜。將昆明小鼠隨機(jī)分為三組，對(duì)照組給予生理鹽水作為陰性對(duì)照，地塞米松組作為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組給予芒果葉提取物，經(jīng)二甲苯誘導(dǎo)炎癥后，通過測(cè)定耳腫脹度作為抗炎藥效指標(biāo)。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，把芒果葉不同極性提取物的抗炎藥效作為參考序列，把芒果葉不同極性溶劑提取物圖譜中特征峰峰面積數(shù)據(jù)作為比較序列，先對(duì)兩組數(shù)列進(jìn)行無量綱化處理，求得兩組數(shù)列的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)，分別計(jì)算各個(gè)指標(biāo)與參考序列對(duì)應(yīng)元素的關(guān)聯(lián)系數(shù)的均值，稱之為為關(guān)聯(lián)序，最后對(duì)關(guān)聯(lián)序進(jìn)行排序，排序靠前則為重要藥效物質(zhì)。最終發(fā)現(xiàn)了芒果葉提取物抗炎作用的部分物質(zhì)基礎(chǔ)是芒果苷及X1(關(guān)聯(lián)系數(shù)=0.901 6)，X3(關(guān)聯(lián)系數(shù)=0.955 8)峰。

1.2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural networks，ANNs)

ANNs是一種模擬人類神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)信號(hào)傳遞方式的并進(jìn)行信息化處理的數(shù)學(xué)建模算法。通過模仿大腦信號(hào)處理和記憶信號(hào)等方式進(jìn)行信號(hào)歸納處理。它具有以下幾個(gè)特點(diǎn)(1)非線性,(2)非局限性,(3)非常定性,(4)非凸性。它的優(yōu)點(diǎn)在于其非線性擬合能力，且不需要實(shí)現(xiàn)建立數(shù)學(xué)模型，充分考慮了事物內(nèi)部作用的復(fù)雜性及關(guān)系的模糊性，對(duì)復(fù)雜的信息進(jìn)行簡(jiǎn)化建模處理。其研究程序一般為:①利用已有的光譜/色譜提取化學(xué)組分信號(hào);②對(duì)信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)換和壓縮，用來提取特征峰的有效信號(hào);③將特征峰的有效信號(hào)與相對(duì)應(yīng)的藥效學(xué)指標(biāo)建立一定的映射函數(shù)關(guān)系，同時(shí)預(yù)測(cè)特征峰的綜合藥效。許雯雯等[8]在建立氣滯胃痛顆粒全時(shí)段多波長(zhǎng)融合指紋圖譜分析方法的基礎(chǔ)上，對(duì)6味藥材隨機(jī)配比成不同比例，用LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，IL-6，NO，檢測(cè)各配比對(duì)這些細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制率作為抗炎藥效指標(biāo)，先用灰色關(guān)聯(lián)度分析將藥效指標(biāo)與各組HPLC指紋圖譜關(guān)聯(lián)得出各色譜峰對(duì)抗炎活性的關(guān)聯(lián)程度，再用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行擬合：先通過程序算法得到BP網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值，再對(duì)測(cè)定值和預(yù)測(cè)值進(jìn)行線形回歸，最后得到回歸系數(shù)為0.983，說明本次實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)性能較佳。

1.3 雙變量相關(guān)分析(bivariate correlations analysis，BCA)

相關(guān)分析是通過對(duì)樣本原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算其相關(guān)性系數(shù)來衡量?jī)山M或幾組數(shù)據(jù)之間的關(guān)系的一種算法[9]。其基本步驟為:①兩組變量的正態(tài)性驗(yàn)證;②兩組數(shù)據(jù)一個(gè)作為橫坐標(biāo)，一個(gè)作為縱坐標(biāo)做散點(diǎn)圖，直觀判斷兩組數(shù)據(jù)是否相關(guān)和相關(guān)類型;③求得相關(guān)系數(shù);④對(duì)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，得出結(jié)論。劉旭等[10]通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈造急性心肌缺血大鼠模型，利用HPLC獲得川芎提取物指紋圖譜，將各有效成分提取出來并給模型大鼠給藥，測(cè)定血清SOD活性、MDA含量作為抗心肌再灌注損傷藥效評(píng)估指標(biāo)。最后將川芎提取物藥效數(shù)據(jù)與指紋圖譜的共有峰的相對(duì)峰面積相關(guān)聯(lián)，運(yùn)用雙變量相關(guān)分析，最終發(fā)現(xiàn)阿魏酸、川芎嗪可顯著降低血清中丙二醛(MDA)等的含量，可顯著升高血清超氧化物歧化酶(SOD)活力，均屬于中藥川芎抗心肌缺血再灌注損傷的主要有效成分。

2 闡明各成分對(duì)藥效貢獻(xiàn)率的方法

通過傳統(tǒng)的藥理學(xué)和藥效學(xué)研究，我們明確了有效成分的藥效作用。再通過有效成分與藥效的關(guān)聯(lián)度預(yù)測(cè)，我們可以得到藥物的譜效關(guān)聯(lián)性。但具體有效成分的分析需要通過多元線性回歸和偏最小二乘回歸分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析進(jìn)行進(jìn)一步闡明。構(gòu)建準(zhǔn)確科學(xué)的回歸模型，可以初步衡量各有效成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)程度。

2.1 多元線性回歸(multiple linear regression，MLR)

多元線性回歸是通過建立多個(gè)自變量和單個(gè)因變量的回歸模型，對(duì)每個(gè)自變量對(duì)因變量的影響程度進(jìn)行參數(shù)評(píng)估的統(tǒng)計(jì)學(xué)經(jīng)典算法。MLR是研究單個(gè)因變量與多個(gè)自變量間的線性回歸模型構(gòu)建的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法[11]。通常用于構(gòu)建非表數(shù)據(jù)與部分表觀易分析測(cè)得指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法，從而實(shí)現(xiàn)通過易測(cè)指標(biāo)對(duì)難測(cè)指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。其主要想法是:①先量化處理數(shù)據(jù)，選取并引入影響程度較大的變量;②計(jì)算逐步回歸方程;③對(duì)回歸方程進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)并評(píng)價(jià)其有效性。吳尤嬌等[12]利用HPLC分析方法得到廣西不同產(chǎn)地的10批毛郁金藥材的指紋圖譜分析。通過高脂飼料喂養(yǎng)建立高脂血癥大鼠模型，連續(xù)3周給藥，設(shè)正常組、高脂模型組、辛伐他汀組和10批不同產(chǎn)地毛郁金乙醇提取物給藥組，以對(duì)高脂大鼠血清CHOL、TG含量降低程度作為降脂藥效指標(biāo)，采用多元線性回歸分析研究各色譜與降血脂作用的相關(guān)性。

2.2 偏最小二乘回歸分析(partial least squares，PLS)

偏最小二乘回歸分析是綜合了多因變量對(duì)多自變量的回歸建模分析和主成分分析在內(nèi)的多元數(shù)據(jù)降維分析方法[13]。特別當(dāng)各變量?jī)?nèi)部高度線性相關(guān)時(shí)，用偏最小二乘回歸分析更有效。另外，偏最小二乘回歸較好地解決了樣本個(gè)數(shù)少于變量個(gè)數(shù)等問題。其主要方法步驟為:①對(duì)自變量與因變量進(jìn)行線性組合;②轉(zhuǎn)變成無相互關(guān)系的綜合變量;③對(duì)新構(gòu)建的綜合變量進(jìn)行回歸分析。鄧書鴻等[14]通過 HPLC 獲得三類黃芪提取物指紋圖譜，以小鼠自入水后到沉入水中 8 s 不能浮出水面的時(shí)間來作為衡量抗疲勞藥效的指標(biāo)。采用偏最小二乘回歸分析方法分析黃芪提取物 HPLC 指紋圖譜與抗疲勞藥效作用之間的譜效關(guān)系。最終結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)譜效關(guān)系有重要貢獻(xiàn)的變量共有36個(gè)(包括黃芪多糖和35個(gè)色譜峰)。

3 重組數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)探尋主要活性成分的方法

隨著越來越多的中藥化學(xué)成分的指紋圖譜的闡明，信息多樣的中藥圖譜所包含的信息也越來越多樣化。由于中藥成分的復(fù)雜性，我們希望找到最主要的藥效成分來進(jìn)一步進(jìn)行新藥開發(fā)。但往往重要的有效成分并不是簡(jiǎn)單地配比，而是多個(gè)變量以不同的效率去影響總體的藥效。通過主成分分析及典型相關(guān)分析的多因素降維算法，將原來多個(gè)維度的數(shù)據(jù)降維成二維或三維數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用以初步判斷各個(gè)化學(xué)成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)效益大小。

3.1 主成分分析法(principal component analysis，PCA)

主成分分析法是經(jīng)典的聚類分析方法之一。主成分的確定由累計(jì)貢獻(xiàn)率和以特征值決定， 累計(jì)貢獻(xiàn)率以>85%且特征值以λi≥1為佳[15]。其基本建模步驟是:①原始指標(biāo)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，并求得各成分間的相關(guān)系數(shù)矩陣R;②求得R矩陣的特征值、特征向量和貢獻(xiàn)率，用貢獻(xiàn)率與特征值確定主成分個(gè)數(shù)并解釋主成分含義;③合成主成分，并得到綜合評(píng)定。劉青萍等[16]采用HPLC法獲取了12批補(bǔ)陽(yáng)還五湯全方和14批補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方的指紋圖譜數(shù)據(jù)，采用大腦中動(dòng)脈線栓法建立大腦中動(dòng)脈閉塞模型，檢測(cè)腦干濕重和腦梗死面積作為腦損傷保護(hù)藥效評(píng)估指標(biāo)，運(yùn)用主成分分析法對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，再運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度法將指紋圖譜特征峰和腦損傷的保護(hù)藥效關(guān)聯(lián)起來，最終發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為tR=6.47、20.65、26.40 min的化學(xué)成分，調(diào)控腦梗死面積、腦水腫的貢獻(xiàn)度最佳。

3.2 典型相關(guān)性分析(canonical correlation analysis，CCA)

典型相關(guān)性分析利用典型的相關(guān)系數(shù)對(duì)兩組變量線性相關(guān)程度進(jìn)行定量描述，是一種簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的分析方法[17]。他的特點(diǎn)是可以通過研究相關(guān)關(guān)系較大的幾對(duì)典型代表變量，替代了兩組變量之間的復(fù)雜相互關(guān)系。分析的步驟:①確定相關(guān)分析中的幾組貢獻(xiàn)率較大的典型變量;②提取典型變量;③正態(tài)性檢驗(yàn)分析;④估計(jì)典型模型，評(píng)價(jià)擬合情況，計(jì)算相關(guān)系數(shù);⑤解釋典型變量;⑥顯著性檢驗(yàn)。于海帥等[18]利用HPLC方法得到了7種產(chǎn)地漏蘆的指紋圖譜，采用噻唑藍(lán)法檢測(cè)了幾種漏蘆對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制增殖作用作為藥效研究指標(biāo)，利用典型相關(guān)分析對(duì)漏蘆成分、藥效數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析。

4 總結(jié)

中藥譜效關(guān)系的建立的核心在于建立中藥指紋圖譜與中藥藥理藥效的映射關(guān)系，當(dāng)然這也是它的難點(diǎn)所在。中藥指紋圖譜包括生物指紋圖譜和化學(xué)指紋圖譜，生物圖譜包括DNA圖譜和蛋白圖譜，主要用于中藥的鑒定，而化學(xué)指紋圖譜則包括了色譜圖譜和光譜圖譜，也就是我們傳統(tǒng)意義上的譜效分析中的“譜”[19]。中藥藥理藥效學(xué)研究與傳統(tǒng)意義上的藥效學(xué)研究的方法一致，通過離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，最終目的在于確定目標(biāo)藥物制劑的藥物效應(yīng)和藥物作用靶點(diǎn)。值得注意的是，中藥指紋圖譜的研究和藥理藥效的研究通常是分開獨(dú)立進(jìn)行的，在研究過程中兩者是互相獨(dú)立的，要找到兩者的相關(guān)聯(lián)系需要選擇合適的數(shù)據(jù)處理技術(shù)來建立兩者之間的相互映射關(guān)系。

第一步需要找到指紋圖譜與藥物之間的相關(guān)關(guān)系。自然界中各個(gè)對(duì)象之間常常存在許許多多的互作關(guān)系，比如協(xié)同、拮抗或者因果關(guān)系等，兩個(gè)對(duì)象之間可能存在幾種以上的互作關(guān)系，所以當(dāng)很多事物聯(lián)系成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)的時(shí)候，其復(fù)雜程度顯而易見。相關(guān)關(guān)系是通過估量?jī)蓚€(gè)事物的變化趨勢(shì)和走向的一致性，來初步推測(cè)兩者之間關(guān)聯(lián)性的一種算法，通過容易觀測(cè)到的指標(biāo)之間的變化來對(duì)對(duì)象內(nèi)部聯(lián)系進(jìn)行推測(cè)。建立初步確定一般相關(guān)關(guān)系之后，需要開始第二歩，即通過簡(jiǎn)單的回歸分析進(jìn)行線性或非線性擬合，初步判斷多個(gè)自變量對(duì)同一個(gè)因變量作用的比重。但我們都知道，自然環(huán)境中的因素并不是簡(jiǎn)單的配比，它具有數(shù)量多且關(guān)系復(fù)雜的特點(diǎn)，因此這時(shí)候我們需要進(jìn)行第三步，即對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，將復(fù)雜且多的數(shù)據(jù)降成二維或三維的數(shù)據(jù)，并尋找到配比最合理，擬合最佳的方式，更加全面地評(píng)估各組分對(duì)于總體藥效的奉獻(xiàn)比重。

當(dāng)然所有的數(shù)據(jù)處理算法都有各自的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，為了能更加準(zhǔn)確合理的對(duì)藥效關(guān)系評(píng)估，需要多種算法的結(jié)合和相互驗(yàn)證，以建立最為科學(xué)合理的“譜-效”數(shù)學(xué)模型。隨著信息化時(shí)代的來臨，各個(gè)領(lǐng)域都面臨著大數(shù)據(jù)的革新，在生命科學(xué)領(lǐng)域和藥物研究領(lǐng)域更是如此。其實(shí)隨著時(shí)代的進(jìn)步，如何更加高效和科學(xué)的開展科學(xué)研究已經(jīng)成為一個(gè)我們不能回避的問題。比如在如今的中藥藥效關(guān)系研究當(dāng)中就存在這樣一個(gè)問題，每個(gè)進(jìn)行藥物成分研究的研究人員在進(jìn)行有效成分提取過后都會(huì)對(duì)藥效進(jìn)行研究，然后建立相應(yīng)的中藥效譜關(guān)系。但研究者們所選用的數(shù)據(jù)算法常常參差不齊，直接影響了最后效譜關(guān)系的有效性。是否可以構(gòu)建一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，做藥理藥效研究的研究者將數(shù)據(jù)上傳，然后統(tǒng)計(jì)分析專家從數(shù)據(jù)庫(kù)下載數(shù)據(jù)，最終建立合理的中藥效譜關(guān)系，它是一個(gè)一對(duì)多的關(guān)系，可以有效地將這些藥理藥效研究進(jìn)行多次利用，在很多領(lǐng)域已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了這種平臺(tái)搭建，比如癌癥的基因組學(xué)和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)?？偟膩碚f，高效準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)處理和分析方法的科學(xué)使用必將推動(dòng)中藥譜效關(guān)系研究的蓬勃發(fā)展。