蕎麥生物活性肽的研究進(jìn)展

李 蒙

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院,陜西 西安 710065)

蕎麥廣泛分布于中國(guó)山區(qū),特別是西南地區(qū),包括四川、貴州等地,除此以外,在俄羅斯、日本等國(guó)家也廣泛種植,常見(jiàn)的品種是甜蕎和苦蕎。蕎麥種子含有多種生物活性成分,如豐富的蛋白質(zhì)、黃酮化合物、肌醇等,蕎麥蛋白在某種程度上與雞蛋、牛奶中的蛋白功能相近[1],且其組成蛋白質(zhì)的氨基酸種類(lèi)全面，配比得當(dāng),含有大量的賴(lài)氨酸、精氨酸和其它必需氨基酸,因此,具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蕎麥蛋白被用于彌補(bǔ)谷類(lèi)和蔬菜類(lèi)蛋白的緊缺[2]。

蕎麥具有很多重要的生物活性物質(zhì),已研究表明其對(duì)多種慢性病有很好的療效,如高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病、肥胖癥和便秘[3]。生物活性肽是具有生物學(xué)活性的數(shù)個(gè)氨基酸組成的多肽,具有不同的生理學(xué)功能[4]。深入研究具有特殊生物活性的蕎麥小分子活性肽,對(duì)于蕎麥蛋白資源的開(kāi)發(fā)利用具有重要的意義[5]。

1 蕎麥中胰蛋白酶抑制劑

在過(guò)去的幾十年里,從蕎麥種子中分離出了多種蛋白酶抑制劑,然后根據(jù)氨基酸序列和酶活性特征被劃分為不同類(lèi),它們?cè)谥行院退嵝詶l件下普遍具有熱穩(wěn)定性。最開(kāi)始人們將苦蕎胰蛋白酶抑制劑分為永久性和短暫性?xún)煞N[6-7],永久性胰蛋白酶抑制劑的特征是序列N端以亮氨酸為起始,由51～67個(gè)氨基酸組成;短暫性胰蛋白酶抑制劑的特征是序列N端以絲氨酸為起始,由85～99個(gè)氨基酸組成,比如蕎麥蛋白酶抑制劑BWI-1(LRQCSGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRAIVLPEGSAVPRDLRCDRVWVFV DERGVVVDTPVVM)和BTI-1(LRQSCGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRAIVLPEGSAVPRDLLCD RVDVFVDERGVVVDTPVVM)為永久性抑制劑[8-9],蛋白酶抑制劑BWI-2a(SDKPQQLLEQCRYLCRIRRWSTDMVHRCQQKCQDDFQRQQRGGGGSSD)和BWI-2b(SDKPQQLLEQCRYLCRIRRWSTDMVHRCQQKCQDD FQRQQRGGGGSSDEGN)為短暫性抑制劑[5]。后來(lái)學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了由41個(gè)氨基酸組成的胰蛋白酶抑制劑BWI-2c(SEKPQQELEECQNVCRMKRWSTEMVHRCEK KCEEKFERQQR)[10],由4個(gè)半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。相關(guān)結(jié)構(gòu)研究表明,半胱氨酸的數(shù)目和二硫鍵的形成是蕎麥蛋白酶抑制劑的三維立體結(jié)構(gòu)所必需的；之后發(fā)現(xiàn)的BWI-4a抑制劑有兩種異構(gòu)酶(序列1:ECSGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRAIVLP EGSAVPRDLRCDRVWVFVDERGVVVDTPVVM和序列2:ECSGKQEWPELVGERGSKAAKIIENENEDVRAI VLPEGSGVPRDLRCDRVWVFVDERGVVVDTPVVM),它們之間的差別是第40位氨基酸的種類(lèi)(丙氨酸和甘氨酸)[11]。以上所有的胰蛋白酶抑制劑都是在甜蕎中發(fā)現(xiàn)的,而從苦蕎種子中分離的FtTI(LIYAKVKCLITGVRTYVGKQSWPELVGTKGKTAAATIDKENAHV TAVLCPPLTTLATCRTFDFRCDRVRVLINRIGGVVTKT PTVG)蛋白酶抑制劑是由86個(gè)氨基酸組成的[12]。

相關(guān)生理活性研究表明，蕎麥蛋白酶抑制劑可以抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,而對(duì)胰凝乳蛋白酶的作用效果不顯著。離子交換色譜分析表明,蛋白酶抑制劑可以劃分為陰離子和陽(yáng)離子抑制劑,如蕎麥中的BWI-1、BTI-1和BWI-4a屬于陰離子抑制劑,而其它植物和細(xì)菌中的BWI-4c(GRGCQGLQEEPELVGTRGPA)屬于陽(yáng)離子抑制劑[13]。除了抑制酶活性外,蛋白酶抑制劑還具有抗菌性,蕎麥蛋白酶抑制劑已被證實(shí)具有抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶活性和多種癌細(xì)胞增殖的作用[14]。蕎麥作為功能性糧食作物,一直得不到廣泛的開(kāi)發(fā)利用,主要在于其產(chǎn)品口味一般以及蛋白質(zhì)的低消化率,這種低消化率是由于蕎麥中胰蛋白酶抑制劑和其它蛋白酶抑制劑影響的結(jié)果。

2 蕎麥中抗菌肽

蕎麥在生長(zhǎng)中會(huì)面臨許多不利的環(huán)境,例如低溫、干旱和病菌感染等,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化,蕎麥已具備抵抗害蟲(chóng)和病菌侵染與損傷的活性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)從蕎麥種子、麩皮和外殼分離的抗菌肽具有對(duì)多種致病菌的抗菌作用[15]。

植物防御素一般由45～54個(gè)氨基酸組成,結(jié)構(gòu)中含有由8個(gè)半胱氨酸組成的4個(gè)二硫鍵[16]。目前,已經(jīng)從小麥、大麥和其它植物中分離與鑒定出多種防御素,其結(jié)構(gòu)與動(dòng)物、人類(lèi)防御素的結(jié)構(gòu)有相似性[8]。人們從甜蕎中分離出兩種抗細(xì)菌肽Fa-AMP1(AQCGAQGGGATCPGGLCCSQWGWCGSTPKYCGAGCQSNCK)和Fa-AMP2(AQCGAQGGGATCPGGLCCSQW GWCGSTPKYCGAGCQSNCK),它們由40個(gè)氨基酸組成,分子內(nèi)有4個(gè)二硫鍵結(jié)構(gòu)[17]?？咕钚苑治霰砻鱂a-AMP1和Fa-AMP2可以抑制真菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)[14]?？咕钚詫?shí)驗(yàn)表明蕎麥胰蛋白酶抑制劑BWI-2c具有抵抗微生物感染的功能[10]。還有從苦蕎種子中分離的FtTI抗菌肽,其由86個(gè)氨基酸組成,分子量為14 kDa,含有兩個(gè)二硫鍵,活性分析表明FtTl在濃度為30 μg/mL時(shí)可以完全抑制植物病原真菌(Mycosphaerellamelonis、Alternariacucumerina、Alternariasolani、Phytophthracapsici和Colletotrichumglaeosporioides)的生長(zhǎng)[12]。還有蛋白酶抑制劑家族中的BWI-1同樣可以抑制真菌(Alternariaalternata和Fusariumoxysporummycelia)的生長(zhǎng)[18]。將BWI-1基因轉(zhuǎn)入煙草和馬鈴薯中,發(fā)現(xiàn)能抑制Pseudomonassyringaepv.tomato和Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis[19]。

3 蕎麥蛋白質(zhì)對(duì)高膽固醇和肥胖的療效

組成蕎麥蛋白質(zhì)的獨(dú)特氨基酸序列能降低小鼠血漿膽固醇,對(duì)高膽固醇血癥有治療作用[20]。當(dāng)未經(jīng)消化的蕎麥蛋白進(jìn)入胃腸道后,會(huì)引起中性固醇的大量流失,擾亂肝腸循環(huán),降低肝膽固醇濃度[21]。通過(guò)用蕎麥蛋白喂養(yǎng)倉(cāng)鼠,刺激膽汁的合成和排出更多酸性和中性類(lèi)固醇,可以防止膽結(jié)石的形成[22]。研究發(fā)現(xiàn)從苦蕎粉碎物中得到的TBP能減少大鼠血清膽固醇，下調(diào)NPC1L1和膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶活性,影響膽固醇的吸收[23-24]。

與其它動(dòng)植物蛋白質(zhì)(如動(dòng)物酪蛋白和大豆蛋白)相比,提取的蕎麥蛋白不但能更有效地降低血液中LDL、VLDL和膽固醇的含量,而且能降低肝脂肪生成酶的活性,例如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和脂肪酸合成酶；此外，蕎麥蛋白在其消耗過(guò)程中能降低肝臟與血漿中三酰甘油濃度，減少脂肪墊濕重[25-26]。

4 蕎麥蛋白質(zhì)的降血糖作用

調(diào)查表明食用蕎麥能降低高血壓、血脂紊亂和高血糖的發(fā)病率[27]。在蕎麥中抗糖尿病的化合物主要為肌醇、黃酮和蛋白質(zhì),黃酮化合物中的蘆丁、槲皮素和其它黃酮類(lèi)化合物能對(duì)氧化應(yīng)激和脂類(lèi)代謝規(guī)律進(jìn)行調(diào)節(jié)[28-30]。活性氧(ROS)會(huì)損傷胰島細(xì)胞膜，引起糖尿病；而攝入蕎麥蛋白后被證明通過(guò)增加抗氧化酶活性和消除ROS來(lái)治療糖尿癥[31-32]。蕎麥幼芽的抗氧化活性能抑制炎癥的發(fā)生和改變糖尿癥患者的葡萄糖耐受性[33-34],通過(guò)酶解將蕎麥蛋白質(zhì)裂解成多肽,增加了清除自由基活性和鐵離子螯合活性[35]。從消化后的蕎麥蛋白質(zhì)中獲得4種抗氧化多肽,分別被命名為WPL、VPW、VFPW和PW,它們比經(jīng)胃蛋白酶和胰酶消化后的蕎麥蛋白質(zhì)混合物具有更強(qiáng)的清除自由基的能力[36]。因此,探究蕎麥蛋白質(zhì)或多肽對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化作用和糖尿病的治療作用具有重要的意義,可以作為治療它們的有利候選藥物。

5 蕎麥的降壓肽

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)在高血壓調(diào)節(jié)過(guò)程中起到重要作用,其中血管緊張素Ⅱ是主要的效應(yīng)肽,而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE,EC3.4.15.1)催化血管緊張素Ι轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ,引起血壓增加[37]。從蕎麥中獲得的多種小分子多肽能抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性,這些小分子多肽主要由2～5個(gè)氨基酸組成。早期人們就從水解后的苦蕎蛋白質(zhì)中分離到了11種抑制肽,分別為FY(Val-Lys)、FY(Phe-Tyr)、AY(Ala-Tyr)、LF(Leu-Phe)、YV(Tyr-Val)、YQ(Tyr-Gln)、YQY(Tyr-Gln-Tyr)、PSY(Pro-Ser-Tyr)、LGI(Leu-Gly-Ile)、ITF(Ile-Thr-Phe)、INSQ(Ile-Asn-Ser-Gln),其中AY、FY、LF和YV與先前報(bào)道的ACE活性抑制肽序列一致[38],之后從發(fā)酵的蕎麥芽中純化出6種降壓肽,分別為DVWY(Asp-Val-Trp-Tyr)、FDART(Phe-Asp-Ala-Arg-Thr)、FQ(Phe-Gln)、VAE(Val-Ala-Glu)、VVG(Val-Val-Gly)和WTFR(Trp-Thr-Phe-Arg),這些天然多肽對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠具有降壓作用[39]。研究發(fā)現(xiàn)多肽中的脯氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性中心相結(jié)合,通過(guò)此方式產(chǎn)生抑制活性作用[40]。而蕎麥降壓肽幾乎都具有相似的結(jié)構(gòu),C端都是酪氨酸,例如FY、AY、YQY、PSY和DVWY,然而GPP(Gly-Pro-Pro)的C端氨基酸是脯氨酸,因此,酪氨酸和脯氨酸對(duì)ACE的抑制作用很重要[41]。

6 蕎麥抗癌蛋白質(zhì)

早期發(fā)現(xiàn)BWI-1和BWI-2a對(duì)人的T-All細(xì)胞系(JURKAT和CCRF-CEM)具有抑制活性,其引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)理與細(xì)胞DNA的變性或破碎有關(guān)[42]。從苦蕎中克隆得到胰蛋白酶抑制劑基因,經(jīng)表達(dá)獲得具有活性的重組胰蛋白酶抑制劑(rBTI),通過(guò)上調(diào)Bax和Bak、下調(diào)Bcl-2和Bcl-xl，經(jīng)線粒體凋亡通路誘導(dǎo)EC9706、HepG2和HeLa細(xì)胞凋亡[43]。通過(guò)噻唑比色法和血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析,發(fā)現(xiàn)rBTI能抑制IM-9細(xì)胞和HL-60細(xì)胞的增殖[44]；經(jīng)rBTI晶體結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)酪蛋白酶抑制劑的作用機(jī)理與其分子構(gòu)象變化有關(guān)[45]。因此,通過(guò)內(nèi)吞作用和膜電位變化,rBTI能進(jìn)入HepG2細(xì)胞[46]。

研究表明蕎麥蛋白經(jīng)消化可阻礙二甲基苯丙蒽誘導(dǎo)性乳腺腫瘤的發(fā)生[47],蕎麥蛋白類(lèi)產(chǎn)品也已經(jīng)被證明通過(guò)降低c-myc和c-fos蛋白的表達(dá),抑制大鼠大腸癌的發(fā)生和抑制細(xì)胞增殖[48]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了一種分子量為57 kDa的水溶性蕎麥蛋白,命名為T(mén)BWSP31[49]；其具有抑制人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的作用；進(jìn)一步研究揭示，通過(guò)上調(diào)Fas和下調(diào)bcl-2,TBWSP31能誘導(dǎo)Bcap37細(xì)胞的凋亡[50-51]。因此,蕎麥蛋白質(zhì)的抗癌作用有待進(jìn)一步發(fā)掘。

7 討論

國(guó)內(nèi)外對(duì)蕎麥蛋白活性肽的制備、純化、結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性的研究取得了很大進(jìn)展,特別是蕎麥的胰蛋白酶抑制劑具有開(kāi)發(fā)成醫(yī)藥制劑的潛在價(jià)值；同時(shí),蕎麥蛋白和其水解的活性肽的降壓作用和降血脂特性已成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn),所以,蕎麥蛋白質(zhì)可以被作為功能型食品添加劑,治療心血管系統(tǒng)疾病。然而,吞食后的蕎麥蛋白在胃腸道的消化與降解條件目前還不是很清楚,因此,深入研究蕎麥蛋白的水解特性,發(fā)掘水解產(chǎn)物中具有特殊生物活性的小分子多肽,對(duì)有效利用蕎麥蛋白資源具有重要意義。