PCR技術在豬肉中微生物檢測的應用

文 昕，韓國全，王成程

（四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川雅安625000）

“國以民為本，民以食為天，食以安為先”，食品安全直接關系到一個國家的人民身體健康、經(jīng)濟有序發(fā)展、社會和諧穩(wěn)定，是頭等大事。因此，保障食品安全既是國家政府的基本職能和重要工作，也是全社會、全人類的共同責任。我國是全球豬肉消費最大國，豬肉作為我國居民最主要的副食品，其消費長期占肉類消費比重的60%以上，可謂是大眾消費的主力軍。但是，近年來關于豬肉的食品安全事件卻屢見不鮮。有數(shù)據(jù)顯示[1]：2005年～2014年間，我國各?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）發(fā)生的豬肉食品安全事件數(shù)總計為774件，其中52%的食品安全事件源于化學性風險（如違規(guī)使用瘦肉精、二惡英、沙丁胺醇等化學品），40%源于物理性風險（如肉中混入外來污染物等），近10%是由微生物風險因素引起的。然而，根據(jù)世界衛(wèi)生組織估計,全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病微生物引起的?？梢姡瑥娜蚍秶鷣砜?，微生物是引發(fā)疾病的根源，這就對我國豬肉流入市場之前的致病微生物檢測提出了更高要求，應當從源頭上保證豬肉的質(zhì)量安全，從而防止食品安全事件大面積爆發(fā)。

目前，應用于生豬肉中微生物檢測的主要技術有：免疫學技術、PCR技術、DNA探針法、基因芯片技術等。由于傳統(tǒng)微生物檢測方法存在檢測成本高、速度慢、效率低的缺陷，因此難以滿足不斷發(fā)展的檢測要求。PCR技術以其特異性強、快速簡便和靈敏度高等優(yōu)點成為最常用的檢驗方法之一。

1 PCR的發(fā)展歷程

1.1 第一代PCR

多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外快速擴增DNA的方法。自1985年建立以來，PCR已成為許多科學研究、臨床和法醫(yī)研究中不可或缺的技術。常規(guī)PCR技術采用瓊脂糖凝膠電泳的方法來對PCR產(chǎn)物進行分析，其擴增過程包括以下3個步驟：DNA分子變性、人工合成引物與變性單鏈DNA退火及堿基擴增。傳統(tǒng)PCR技術相對于選擇性培養(yǎng)、單克隆挑選等方法而言，選擇性更強、靈敏度更高。但這一方法容易因引物設計的缺陷或檢測品中的某些物質(zhì)抑制PCR反應而出現(xiàn)假陽性，因此主要適用于定性和半定量的食源性微生物研究。

1.2 第二代PCR

十幾年來，PCR技術從定性到定量，經(jīng)歷了實質(zhì)性地發(fā)展變革。第二代PCR技術包括反轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR、巢式PCR、免疫PCR、實時熒光定量PCR等。其中實時熒光定量PCR（fluorescent quantitative real-time PCR）是近年來研發(fā)的新技術，能準確地量化給定樣本中的目標DNA。該技術以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎，在PCR反應中加入熒光分子作為標記，由于熒光染料發(fā)射出的熒光訊號強度與DNA產(chǎn)量成正比，利用已知起始拷貝數(shù)的標準品做出標準曲線，即可對熒光信號進行“實時”檢測，計算出樣品起始拷貝數(shù)。相較于常規(guī)PCR檢測技術，熒光定量PCR檢測技術有了進一步的創(chuàng)新和改進，一般有染料法和探針法。探針法中基于TaqManTM技術具有一定的優(yōu)勢，具有高靈敏度、高特異性和再現(xiàn)性，已被廣泛用于致病生物檢測、癌癥研究、基因表達及多態(tài)性研究。但是，正因為其高特異性，導致只適用于一個特定的目標且價格較為昂貴。

1.3 第三代PCR

隨著科研需求的不斷提高，定量PCR技術也存在多種因素對DNA的擴增過程造成影響，循環(huán)閾值（Ct）不能保證恒定不變，也只能是“相對定量”。此時，能夠進行“絕對定量”的新技術——數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）應運而生。數(shù)字PCR是通過將一定限度的稀釋樣品分布到成千上萬的反應單元中進行微反應，并使每個反應單元存在一個或多個拷貝的目標分子。通過PCR擴增和熒光信號分析，再利用泊松統(tǒng)計分布的陽性計數(shù)，得到樣品中的DNA分子密度[2]。數(shù)字PCR主要包括 3大類，即微反應室 /孔板（Micro．chamber）、微流控芯片（Microfluidicchip）和微滴PCR系統(tǒng)（droplet digital PCRsystem，ddPCR）。數(shù)字PCR已被廣泛應用于突變檢測、拷貝數(shù)變異分析、產(chǎn)前診斷、轉(zhuǎn)基因食品檢測。其缺點有：一是由于系統(tǒng)開放，通過擴增的PCR產(chǎn)物有可能污染環(huán)境；二是由于其是一個手動系統(tǒng)，因此相當耗費人力。

2 PCR技術在豬肉中微生物檢測的研究進展

2.1 PCR技術檢測豬肉中沙門氏菌

沙門氏菌是一種全球性食源性病原體，大約占美國食源性疾病暴發(fā)的30%，占歐盟的23%，我國內(nèi)陸地區(qū)食源性疾病爆發(fā)也以沙門氏菌引發(fā)為首。豬肉是人類沙門氏菌病的重要來源，因此快速檢測豬肉中沙門氏菌有利于防止沙門氏菌食物中毒。在國內(nèi)研究者中，姚大偉[3]等人根據(jù)沙門氏菌ttrBCA基因設計引物和探針，建立了含擴增內(nèi)標的生鮮豬肉中沙門氏菌Real-time PCR檢測方法，該方法能在12h內(nèi)對人工污染沙門氏菌的豬肉樣品做出檢測，并且可以避免假陽性現(xiàn)象的產(chǎn)生。王靜[4]等人經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，在0．1%脫氧膽酸鈉（SD）和 40μg/ml PMA的協(xié)同作用下，可以有效抑制 108cfu/mL的沙門氏菌死菌DNA進行PCR擴增，而不抑制活菌DNA擴增。這種結(jié)合疊氮溴化丙錠(PMA)與微滴數(shù)字PCR（ddPCR）的技術，可以專門對豬肉中的沙門氏菌活菌進行檢測。在國外研究學者中，Caterina Agrimonti[5]等人利用實時定量PCR（qtPCR）技術，加入SYBR GreenER來定量檢測豬肉中沙門氏菌，檢出限達102cfus/ml。

2.2 PCR技術檢測豬肉中大腸桿菌O157:H7

腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC）是能引起人出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌。主要菌型大腸桿菌O157:H7是一種新型腸道致病菌，是全球公認的重要致病菌和人獸共患病病原微生物，以牛、羊、豬等家畜為主要宿主。在國內(nèi)研究者中，夏燦[6]等人根據(jù)GenBank公布的大腸桿菌O157：H7的菌體抗原基因rfbE、鞭毛抗原基因fliC、溶血素基因hlyA、緊密黏附素基因eaeA和志賀樣毒素基因stxl和stx2的序列，分別設計6對特異性的引物及相應的Taqman探針，建立快速、特異性地檢測大腸桿菌O157：H7及其4個主要毒力基因的三重熒光定量PCR方法。在國外研究者中，Sher Bahadar Khan[7]等人對325份肌肉和組織及豬場樣本使用MPN-PCR方法，以flicH7和rfbO157為目的基因，檢測了其中O157:H7大腸桿菌的含量并進行菌株分離和毒力實驗。

2.3 PCR技術檢測豬肉中單核細胞增生李斯特氏菌

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes,以下簡稱單增李氏菌）是一種能引起人畜共患的食源性致病菌，廣泛分布于土壤、污水、人和動物的糞便、飼料及多種食品中。單增李氏菌有嚴重的致病性,可以引發(fā)腦膜炎、孕婦流產(chǎn)、敗血癥及食物中毒。由于該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，因此是未殺菌的冷藏食品主要病原菌。在國內(nèi)研究者中，李丹丹[8]以iap基因為靶基因，設計合成引物及TaqMan探針，建立實時熒光定量PCR快速檢測方法。靈敏度為6．5cfu/mL。李慧[9]選取hlyA基因為靶基因，利用熒光定量PCR與鎖定寡核苷酸（LNA）相結(jié)合的方法，對比三種從豬肉中提取單增李氏菌的方法，優(yōu)化后最終純菌培養(yǎng)物檢測靈敏度可以達到30 copies/μL，1．2×10 cfu/mL；人工污染豬肉檢出限可以達到48 copies/μL，3．2×102cfu/mL。在國外研究者中，Keping Ye[10]等人采用RT-PCR法檢測冷凍豬肉中單增李氏菌，不需要預富集步驟，在與肉類相關的其他41種菌株中均無擴增信號，特異性良好。在純培養(yǎng)和人工污染冷凍豬肉樣品中，檢測限為100 cfu/mL。

2.4 PCR技術檢測豬肉中金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌隸屬于葡萄球菌屬，是革蘭氏陽性菌的代表。它是引起人、動物化膿感染的重要致病菌，產(chǎn)生的腸毒素容易造成人食物中毒，因為產(chǎn)生的腸毒素有極高的熱穩(wěn)定性，100℃下30 min不會失活，因此食品一旦被污染，即使經(jīng)過高溫烹煮仍然可能致病。據(jù)報道，在對市場進行隨機抽樣檢測中發(fā)現(xiàn)，生肉類的金黃色葡萄球菌檢出率高達18．5%，早年間該數(shù)值甚至更高。這暴露出在肉類食品加工、貯藏、運輸?shù)戒N售的各個環(huán)節(jié)都存在漏洞，應當引起監(jiān)管部門的高度重視。在國內(nèi)研究者中，李苗云[11]等人以金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因（nuc）為靶基因，結(jié)合BP平板計數(shù)法建立20℃條件生鮮豬肉中金黃色葡萄球菌的熒光定量PCR檢測方法。實驗結(jié)果表明，進入穩(wěn)定期后，熒光定量PCR檢測結(jié)果高于傳統(tǒng)平板計數(shù)。在國外研究者中，Viktoria Atanassova[12]等人在135個生豬肉樣本中，通過RFLP-PCR檢測出62．2%的樣品感染金黃色葡萄球菌，而使用傳統(tǒng)的PCR方法檢測的結(jié)果只有57．7%。ZP Guan[13]等人通過設計5對特異性引物來鑒定豬肉中沙門氏菌（invA基因），單核細胞增生李斯特菌（hlyA基因），大腸桿菌 O157：H7（rfbE基因），金黃色葡萄球菌（nuc基因）和小腸結(jié)腸炎菌（ail基因），建立并優(yōu)化多重PCR體系。實驗結(jié)果表明，過夜培養(yǎng)后，同時檢測5種目標病原體的檢測限為103cfu/mL，檢測單一病原體的檢測限小于10 cfu/mL，其中檢測金黃色葡萄球菌的檢測水平為51 cfu/mL。

3 結(jié)語

目前，PCR技術已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因成分、動物源性成分和食源性致病微生物的定量檢測中得到了廣泛的應用,但在食源性致病微生物方面還應該有更好的發(fā)展。隨著該技術的推廣與應用，一方面縮短了檢測時間，提高檢測效率,提升食品安全衛(wèi)生的檢測水平；另一方面為食品安全風險預警系統(tǒng)的建立奠定了基礎,為人們的健康生活保駕護航。

但就應用現(xiàn)狀而言，單純PCR技術仍存在一些缺陷：如若病原微生物具有高度變異性，則容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；不能檢測擴增產(chǎn)物的大小、每位研究者用于生成標準曲線的樣品不同，沒有參考的意義等。今后改進的方向可以從實驗的各個階段入手：例如在前處理階段，綜合應用凍融、超聲、搖床、勻漿、PMA等技術；在DNA提取階段，可以結(jié)合DNA提取試劑盒、TZ裂解液提取法、SDS高鹽提取法、FTA濾膜等方法；樣品的分離純化階段，可以結(jié)合免疫磁珠分離技術等；在微生物檢測階段，可以結(jié)合LAMP技術、比較應用染料法或探針法等。PCR技術的應用范圍也可以從豬肉中微生物定性和定量檢測、肉源性成分的確定以及新鮮度指標的應用拓展到食品安全的更多領域。