酶聯(lián)免疫試劑盒檢測雞肉呋喃唑酮代謝物

趙敬翠

（遼寧省朝陽市建平縣畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所122400）

呋喃唑酮是人工合成的硝基呋喃類抗菌藥物，屬于廣譜抗菌藥，對常見的革蘭氏陰性菌 （大腸桿菌、沙門氏菌）和陽性菌有抑制作用，對真菌、原蟲等也有很好的殺滅效果，可用于治療細(xì)菌和原蟲引起的痢疾、腸炎、胃潰瘍等胃腸道疾患。呋喃唑酮進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)很快被分解，其代謝物有致癌、致畸等作用。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部將呋喃唑酮列為禁止使用的藥物，不得在動(dòng)物性食品中檢出。FDA也于2002年禁止了硝基呋喃類 (包括呋喃唑酮)在動(dòng)物性食品中的使用。

目前建平縣區(qū)常用酶聯(lián)免疫吸附法來檢測雞肉中呋喃唑酮代謝物。本文用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測雞肉中呋喃唑酮代謝物的含量，其原理是待測樣品中的呋喃唑酮代謝物經(jīng)衍生化后與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競爭抗體，當(dāng)樣品中呋喃唑酮代謝物含量少時(shí)，更多的抗體就會(huì)與酶標(biāo)板上的抗原結(jié)合而被固定在酶標(biāo)板上，加入酶標(biāo)記物，催化底物顯色，顏色為深藍(lán)色；反之，含量多時(shí)，顏色為淺藍(lán)色。

1 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

1.1 樣品前處理

在建平縣屠宰廠隨機(jī)抽取代表性樣品 （雞肉）40批次，每個(gè)樣品取雞腿部肌肉，精確秤取1±0.01g，均質(zhì)后的樣品于50ml離心管中；依次加入4ml去離子水、0.5ml1M鹽酸和80μl50mM鄰硝基苯甲醛，充分渦動(dòng)1min至組織充分分散；衍生化1.5h；依次加入5ml緩沖溶液、400μl1M氫氧化鈉和6ml乙酸乙酯，劇烈渦動(dòng)1min，4000g以上離心 10min，取 3ml上清液于新的離心管中，50～60℃水浴中，氮?dú)獯蹈?；加?ml正己烷，再加入1ml樣品稀釋液，高速渦動(dòng)30s，4000g以上離心5min，完全棄去上層正己烷及中間層雜質(zhì)或小心吸取下層清液500μl于干凈離心管中；取 50μl進(jìn)行檢測。

1.2 試劑盒及回溫

呋喃唑酮代謝物酶聯(lián)免疫試劑盒（II型）購自北京維德維康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)前將試劑盒放于室內(nèi)恢復(fù)至室溫23～27℃。

1.3 陽性對照品的制備

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定陽性對照濃度為0.2ppb， 取濃度0.81ppb標(biāo)準(zhǔn)品247.0μl添加到1g空白樣品中，成為濃度0.2ppb的陽性對照品，用于計(jì)算陽性對照回收率。前處理同前。

2 檢測步驟

（1）取出酶標(biāo)板，做雙孔平行，記錄標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照品和樣品的位置。

（2）在酶標(biāo)板孔依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照品、陰性對照品和其它待測樣品均為50μl。添加不同樣品時(shí)需更換槍頭，防止交叉污染。

（3）每孔加入50μl酶標(biāo)記物工作液，再每孔加入50μl抗體工作液，用蓋板膜蓋好酶標(biāo)板，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，避光反應(yīng)30min。

（4）洗板嚴(yán)格按照說明書要求操作。

（5）洗板后拍干，立即在每孔中加入100μl底物A、B混合液。用蓋板膜蓋好酶標(biāo)板，輕輕振蕩酶標(biāo)板，避光反應(yīng) 15～20min。

（6）揭開蓋板膜，每孔中加入50μl終止液，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻。5min內(nèi)，用酶標(biāo)儀在雙波長450nm、630nm下讀取酶標(biāo)板吸光度值，并將數(shù)值打印出來。

3 計(jì)算陽性對照回收率

利用電腦上r-biopharm數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出所有檢測樣品中呋喃唑酮代謝物的含量?；厥章?（%）=（實(shí)測陽性對照濃度-實(shí)測陰性對照濃度）÷添加濃度 （0.2ppb）×100%，本次檢測回收率為95%，在75～105%范圍內(nèi)，說明此次檢測和結(jié)果準(zhǔn)確性高。

4 討論

試劑盒要求貯存溫度為2～8℃，因?yàn)榭贵w和酶標(biāo)Ⅱ抗在常溫下易變性。

加樣時(shí)移液槍應(yīng)垂直于板孔，防止將液體加在孔壁上部，加不同樣品時(shí)要注意更換槍頭，避免交叉污染。

洗板是很關(guān)鍵的一步。洗滌次數(shù)和每次加液量及間隔時(shí)間都要嚴(yán)格按照說明書要求操作，使游離的與結(jié)合的酶標(biāo)記物的達(dá)到分離目的，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

底物A、B混合液嚴(yán)格按1：1比例充分混合，必須在5min內(nèi)使用，不能使用金屬盛裝、攪拌試劑。

目前，酶聯(lián)免疫吸附法是我們檢測藥物殘留的常用方法之一。此方法具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)，適用于大批量樣品篩查。