應(yīng)用RACE法克隆雷竹筍PAL基因及序列分析

張規(guī)富,汪 浩

(湖北科技學(xué)院 核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

雷竹(Phyllostachyspraecoxf.prevernalis)屬禾本科剛竹屬,原產(chǎn)于浙江臨安一帶；鮮雷竹筍富含營養(yǎng)成分,是頗受歡迎的綠色保健食品[1]。雷竹筍被挖取后驟然離體,體內(nèi)會產(chǎn)生一系列的生理生化變化,導(dǎo)致迅速老化而喪失鮮嫩可口的食用品質(zhì),主要表現(xiàn)為纖維素和木質(zhì)素含量增加,使筍體變硬,含水量降低,營養(yǎng)成分減少[2]。這種木質(zhì)化過程是在一系列酶促反應(yīng)下進(jìn)行的,其中苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia-Lyase, PAL;EC4.3.1.5)起著重要的作用；PAL是苯丙烷途徑的限速酶,它的活性與木質(zhì)素芳香醇的產(chǎn)量密切相關(guān),直接影響木質(zhì)素的合成[3]。

目前,一些研究者已對擬南芥[4]、煙草[5]、番茄[6]、葡萄[7]、銀杏[8]、香蕉[9]、毛竹[10]、桂花[11]、夏枯草[12]等多種植物的PAL基因進(jìn)行了cDNA克隆、序列分析以及蛋白質(zhì)的功能研究,但有關(guān)雷竹筍PAL基因的研究尚未見報(bào)道。本研究采用RT-PCR及RACE方法克隆了鮮雷竹筍的PAL基因并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,旨在為采后雷竹筍的保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

雷竹筍由湖北瑞發(fā)生物工程股份有限公司提供。去除筍葉，先用流水沖洗,后用雙蒸水沖洗4～5 min,在75%乙醇中浸泡30 s,取出用雙蒸水沖洗4次,將筍體表面殘存的水分用滅菌濾紙吸干后置于液氮中快速冷卻,放置于-80 ℃冰箱中備用。菌株為實(shí)驗(yàn)室自備。pMD?18-T Simple Vectorkit購自美國Invitrogen公司。多糖多酚類植物RNA提取試劑盒、Version 2.0 5′ RACE試劑盒、SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit User Mannual試劑盒、膠回收試劑盒均購自武漢泰晟生物有限公司。引物合成及序列測定由武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室和上海生工公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照NCBI上已發(fā)表的禾本科PAL基因家族的保守區(qū)序列,采用簡并引物設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)PCR引物。根據(jù)引物試劑盒及擴(kuò)增序列的要求,利用Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)RACE引物(表1)。上述引物均由武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室合成。

表1 設(shè)計(jì)的PCR引物

1.2.2 總RNA的提取 鮮雷竹筍的總RNA的提取參照楊衛(wèi)東等[13]的方法。用無菌DEPC水溶解提取的總RNA,RNA的完整性用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,通過OD260/OD280來確定RNA的純度,于-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 中間片段的釣取 以雷竹筍近緣物種的保守序列設(shè)計(jì)引物PALF4、PALR4,然后進(jìn)行擴(kuò)增，釣取中間片段。

1.2.4PAL基因的5′RACE 5′RACEPAL基因的5′端序列采用Invitrogen公司的Version 2.0 5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends試劑盒獲得。對雷竹筍總RNA進(jìn)行PAL基因第一鏈cDNA的合成使用Superscript II RT酶和引物GSP-1。對合成的cDNA進(jìn)行去RNA處理使用RNase Mix。對經(jīng)RNase處理過的cDNA進(jìn)行純化使用DNA純化系統(tǒng)GLASSMAX DNA isolation spin cartridges。對純化后的cDNA末端加上多聚C使用dCTP和TdT酶。對已經(jīng)加dC尾的cDNA進(jìn)行PCR第一輪擴(kuò)增使用試劑盒里面帶的橋連鉚釘引物AAP和引物GSP-2,擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性94 ℃ 1～2 min，變性94 ℃ 0.5～1 min，引物退火55 ℃ 0.5～1 min，引物延伸72 ℃ 1～2 min,共30～35個循環(huán);72 ℃最后延伸5～7 min,5 ℃擱置,直到樣品被移出。稀釋5 μL第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物到495 μL TE緩沖液中，巢式PCR第二輪擴(kuò)增使用試劑盒里面的橋連通用擴(kuò)增引物AUAP和引物GSP-3,擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃ 45 s,引物退火55 ℃ 45 s,引物延伸72 ℃ 1 min,共35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。第二輪PCR產(chǎn)物電泳后,切膠回收純化目的條帶。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18T連接,送上海生工公司，對轉(zhuǎn)化后的陽性克隆進(jìn)行測序。

1.2.5PAL基因的3′RACE 3′RACEPAL基因的3′端序列采用Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得。對雷竹筍總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA使用引物3′CDS primer A和逆轉(zhuǎn)錄酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase。以該cDNA為模板,使用引物3′905-1和UPM(Universal Primer A Mix)進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序與1.2.4第一輪相同。稀釋第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物50倍,用引物UPM和3′905-2進(jìn)行第二輪擴(kuò)增,擴(kuò)增程序與1.2.4第二輪相同。將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,切膠回收純化目的條帶。將純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工測序。

1.2.6PAL基因的全長拼接及序列分析 對5′RACE和3′RACE序列測序結(jié)果使用DNAman軟件進(jìn)行拼接,全長序列理化分析使用DNAstar軟件,PAL基因核苷酸及其編碼的氨基酸同源性分析、氨基酸進(jìn)化樹的構(gòu)建使用MegAlign軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 雷竹筍總RNA的提取

用多糖多酚類植物RNA提取試劑盒抽提鮮雷竹筍的總RNA,所提取總RNA的質(zhì)量用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測,OD260/OD280=2.07,表明所提取的總RNA的質(zhì)量達(dá)標(biāo);對所提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,可見兩條清晰的條帶,無明顯拖帶(圖1),表明該總RNA無降解,可用于后續(xù)研究。

圖1 雷竹筍RNA的電泳鑒定結(jié)果

2.2 雷竹筍PAL基因中間片段的釣取

以設(shè)計(jì)的引物PALF4、PALR4擴(kuò)增釣取雷竹筍PAL基因的中間片段,產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,得到1條長603 bp的特異性擴(kuò)增條帶(圖2),其中有效的中間片段長503 bp。

1:中間片段PCR產(chǎn)物; M: Marker相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 雷竹筍PAL基因的5′RACE

用從筍尖組織提取的總RNA為模板,經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增,采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析,檢測到1條特異擴(kuò)增條帶,大小為250～500 bp(圖3)。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18T連接,對轉(zhuǎn)化后的陽性克隆進(jìn)行測序,大小為463 bp；5′RACE末端附近由于加接頭的實(shí)驗(yàn)特殊性,導(dǎo)致100多個堿基可能不準(zhǔn)確,正確的編碼區(qū)序列長305 bp。

1：5′PAL基因PCR產(chǎn)物; M： Marker相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 雷竹筍PAL基因的3′RACE

對雷竹筍總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA,經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,檢測到1條特異擴(kuò)增條帶,大小為1000～2000 bp(圖4)。將純化后的PCR產(chǎn)物送至上海生工公司直接測序,得到堿基序列含1445 bp,拼接時有效的堿基序列含1397 bp。

2.5 雷竹筍PAL基因的序列分析

雷竹筍PAL基因5′RACE、中間片段和3′RACE堿基序列通過DNAman軟件拼接,得到2511 bp的全長cDNA序列,核苷酸序列的94～2196 bp區(qū)域?yàn)殚_放閱讀框,總長2103 bp。PAL基因共編碼701個氨基酸的多肽(圖5)。

1：3′PAL基因PCR產(chǎn)物; M：Marker相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

從圖5可以看出,在701個氨基酸中,強(qiáng)酸性氨基酸(D,E)78個,強(qiáng)堿性氨基酸(K,R)73個,疏水性氨基酸(A,I,L,F,W,V,M,P)310個,極性氨基酸(G,S,Y,C,T,N,Q,K,R,H,D,E)391個?？傮w上,PAL蛋白中極性氨基酸的數(shù)目較多,可以推斷,PAL蛋白屬于親水性蛋白。

使用DNAStar軟件進(jìn)行分析,PAL基因序列分析結(jié)果見表2。從表2可知,預(yù)測PAL蛋白分子質(zhì)量為75.624 kD,預(yù)測蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為6.41。在2103個堿基中:A占14.58%,C占29.39%,G占36.47%,T占19.56%,(A+T)占34.14%,(C+G)占65.86%。

表2 雷竹筍PAL基因序列分析結(jié)果

2.6 雷竹PAL蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

采用SOPMA工具分析二級結(jié)構(gòu)在雷竹PAL蛋白中的比例,結(jié)果如表3所示。由表3可以看出,雷竹PAL蛋白的二級結(jié)構(gòu)具有豐富的α螺旋和螺旋卷曲,而β折疊片層結(jié)構(gòu)和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)所占比例較低。

表3 PAL蛋白二級結(jié)構(gòu)所占比例

2.7 雷竹PAL蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SWISS-MODEL同源建模的方法分析和預(yù)測得到PAL蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型(圖6)。從圖6可見：雷竹PAL蛋白三維結(jié)構(gòu)模型的模板為1w27.1.A,兩者序列的同一性達(dá)到70.75%,說明兩者的三維結(jié)構(gòu)基本相同；GMQE值(全球性模型質(zhì)量估測值)為0.85,說明建模質(zhì)量較好；QMEAN4為2.95，小于4,說明綜合計(jì)分的質(zhì)量估計(jì)較好；PAL蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型為一個帶柄的圓錐形。

圖5 雷竹PAL基因編碼區(qū)核酸序列和由此推導(dǎo)的氨基酸序列

2.8 雷竹PAL基因核苷酸序列比較與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

使用MEGA 5.03軟件將雷竹PAL基因的核苷酸序列與NCBI中31種已經(jīng)發(fā)表的植物核苷酸序列進(jìn)行距離和系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果(圖7)顯示：雷竹PAL與禾本科竹亞科植物毛竹(Phyllostachysedulis)、綠竹(Bambusaoldhamii)的親緣關(guān)系最近;與禾本科植物小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)、水稻(Oryzasativa)、佛肚竹(Bambusaventricosa)的親緣關(guān)系較近;與玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

左圖中紅色部分為α螺旋；黃色部分為β折疊片；藍(lán)色和綠色部分為螺旋卷曲。

圖7 雷竹PAL基因核苷酸序列的進(jìn)化樹分析結(jié)果

3 討論

在高等植物中PAL基因廣泛存在,是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶和限速酶[14]。PAL基因的編碼區(qū)長度變化不大,一般在2100 bp左右[15]。本研究從鮮雷竹筍中分離得到的PAL基因所含的cDNA的開放閱讀框長度為2103 bp,編碼701個氨基酸；而與雷竹筍同科的高節(jié)竹、龍鱗竹、白哺雞竹、麗水苦竹這4種竹種PAL基因的編碼區(qū)長均為2136 bp,編碼712個氨基酸[16]。說明即使是同科的植物種類,PAL基因也可能存在個性差異。大多數(shù)植物PAL基因唯一的內(nèi)含子位置是保守的,且長度變化很大[15]。5種竹子均具有一個保守的PAL活性位點(diǎn)Ala-Ser-Gly(A-S-G)(圖5中雷竹氨基酸序列549-550-551),說明同科植物PAL基因的內(nèi)含子長度變化甚微。PAL基因的表達(dá)在植物中具有組織特異性,且不同家族成員的同一物種PAL基因的表達(dá)也不同[10],因此,PAL同源基因在雷竹筍中是否存在還有待應(yīng)用Southern雜交等方法進(jìn)行進(jìn)一步分析。本研究已完成了PAL蛋白二級結(jié)構(gòu)分析以及三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測,下一步計(jì)劃通過改變PAL蛋白的結(jié)構(gòu)來探討PAL基因?qū)字窆S生理生化的影響,從而進(jìn)一步構(gòu)建RNA干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)至雷竹筍中,探究PAL基因在雷竹木質(zhì)素合成過程中的作用機(jī)制。

4 小結(jié)

本研究成功地從鮮雷竹筍中分離得到了一個全長PAL基因,其開放閱讀框長度為2103 bp,共編碼701個氨基酸,含1個保守的活性位點(diǎn)Ala-Ser-Gly(A-S-G)；預(yù)測PAL蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為75.624 kD,等電點(diǎn)為6.41；在2103個堿基中，A占14.58%,C占29.39%,G占36.47%,T占19.56%,(A+T)占34.14%,(C+G)占65.86%；在PAL蛋白的二級結(jié)構(gòu)中含有大量的α螺旋和β折疊；其三級結(jié)構(gòu)模型為一個帶柄的圓錐形。

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