附子配伍甘草對大鼠心肌細胞毒性機制的研究進展

李文，傅超美，傅舒

附子為毛茛科植物烏頭 （Aconitum carmichaeliDebx.）子根的加工品，具有回陽救逆，補火助陽，散寒止痛之功效，主治亡陽虛脫、心陽不足、寒凝疼痛等證，為“回陽救逆第一品藥”?，F(xiàn)代研究表明附子中含有多種強心的化學(xué)成分，如烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等，此類雙酯型生物堿有具有強心、抗心律失常、鎮(zhèn)痛抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理作用，但心臟也是附子毒性的靶器官，烏頭堿是附子引起心律失常的重要毒性物質(zhì)基礎(chǔ)，表現(xiàn)出對心肌細胞、中樞神經(jīng)和肌肉組織的毒性反應(yīng)[1-4]。甘草為豆科植物甘草（GlycyrrhiauralensisFisch.）、脹果甘草（G.inflataBat.）或光果甘草（G.glabraL.）的根及根莖。具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效。

在《景岳全書?本草正?毒草部》中曰：“附子之性急，得甘草而后緩；附子之性毒，得甘草而后解；附子之性走，得甘草而后宜心脾；附子之性散，得甘草而后調(diào)營衛(wèi)”。甘草能解附子之毒早已被多數(shù)人認識，但附子-甘草配伍減毒的作用機制眾說紛紜，包括化學(xué)成分、藥效毒性、分子機制、組分配伍胃腸吸收動力學(xué)等諸多方面。

組分配伍是中藥傳統(tǒng)“配伍和合”的繼承和發(fā)展。傳統(tǒng)中藥配伍多為飲片配伍，常具有成分繁雜、作用機制不明等不足。張伯禮、王永炎院士提出“組分中藥”理論，基于中藥配伍理論，通過組分間相互作用研究，理清藥味間相互作用關(guān)系，并通過多因素、動態(tài)藥理模型指導(dǎo)辨證施治。組分配伍是遵循“復(fù)雜-簡單-復(fù)雜”研究原則，闡明中藥配伍關(guān)系的新模式。

《素問》云：“主病之謂君，佐君之謂臣，應(yīng)臣之謂使”。組分配伍在明確有效成分、作用機制和靶點的基礎(chǔ)上，按照中醫(yī)“君臣佐使”理論進行辯證選藥組方入藥，既堅持中醫(yī)藥整體觀，又充分發(fā)揮中藥多靶點、多環(huán)節(jié)、多渠道的綜合療效優(yōu)勢，是系統(tǒng)思維與分析還原法的有機結(jié)合。陳竺科研組基于中藥復(fù)方（雄黃、青黛、丹參）的有效組成，將其主要成分四硫化四砷、靛玉紅、丹參酮IIA，按照分子配伍理論組方，有效緩解急性早幼粒細胞性白血病，成為現(xiàn)代中藥治療重大疾病的標(biāo)桿。其中四硫化四砷作“君藥”，它直接作用于癌蛋白，通過誘導(dǎo)其降解，從根本上逆轉(zhuǎn)癌細胞的瘋長，使其分化成熟；丹參酮和靛玉紅作為“臣藥”，促進白血病細胞的分化成熟，抑制癌細胞的細胞周期及分裂增殖；并且丹參酮和靛玉紅通過增加負責(zé)運輸硫化砷的蛋白的基因表達，促使硫化砷更多進入細胞，起到了“佐使藥”的作用。國際主流科學(xué)界對這一研究成果給予積極評價，《Nature》雜志發(fā)表了題為“中醫(yī)藥：古老復(fù)方的現(xiàn)代新解”的述評。此外，謝恬科研組基于欖香烯三種構(gòu)型（β-，γ-，δ-欖香烯）的藥效機制，結(jié)合組分配伍理論，以具有顯著殺腫瘤細胞作用的β-欖香烯作為“君藥”，γ-，δ-欖香烯可顯著增強β-欖香烯抗腫瘤作用，為“臣藥”，輔以適宜輔料將其組方研發(fā)成為欖香烯抗癌新藥，具有減毒增效的制劑優(yōu)勢。

本文將對近年來附子配伍甘草對大鼠心肌細胞減毒作用機制進行綜述，以期為中藥復(fù)方配伍減毒研究提供參考，為中藥臨床合理應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 附子對心肌細胞的毒性

1.1 烏頭堿對心肌細胞內(nèi)電生理的影響

中藥有多成分、多靶點、弱效應(yīng)的特點，學(xué)者們常常選擇其主要有效成分作為研究對象來闡釋藥物作用機理。附子中主要成分烏頭堿是引起心律失常的重要毒性物質(zhì)基礎(chǔ)，所以研究中常常采用烏頭堿作為代表研究附子的心肌細胞毒性。心肌細胞膜上有多種離子通道，離子通道是一類跨膜糖蛋白，如Na+、K+、Ca2+、Cl-通道等, 這些離子通道節(jié)律性的開放和關(guān)閉，通過正常表達與功能的彼此平衡來維持心臟的正常功能。Na+、K+、Ca2+、Cl-等離子流參與了心肌動作電位的形成，任何離子通道電流發(fā)生異常，均可導(dǎo)致心肌細胞電生理功能的改變，嚴重的可致心律失常。

附子中的主要有效成分烏頭堿的心臟毒性與心肌細胞內(nèi)Ca2+和Na+濃度及相關(guān)離子泵、ATP酶相關(guān)。王茁伉等[6]給予SD乳鼠心肌細胞烏頭堿，應(yīng)用試劑盒檢測心肌細胞內(nèi)Na+、K+、Ca2+的離子含量，以及Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力，結(jié)果15min后細胞內(nèi)Na+和Ca2+含量增加，而K+含量減少，具有劑量依賴性，同時抑制細胞Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性。通過測四噻唑蘭MTT（OD570-655）的值判斷心肌細胞的活力，結(jié)果顯示，烏頭堿可以導(dǎo)致心肌細胞活力的降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

Fu等[7]研究發(fā)現(xiàn)烏頭堿能引起大鼠心肌細胞毒性，表現(xiàn)在心肌細胞內(nèi)Ca2+的濃度有顯著性異常，能被Ca2+抑制劑拮抗，故認為附子心臟毒性的主要機制是Ca2+轉(zhuǎn)運失調(diào)和細胞內(nèi)的電耦聯(lián)障礙導(dǎo)致了心律失常。進一步研究表明，烏頭堿可破壞心肌細胞超微結(jié)構(gòu)和細胞膜穩(wěn)定性，使能量代謝紊亂，影響到細胞膜的Ca2+-ATP酶活性，細胞外的鈣離子可經(jīng)電壓門控式L型Ca2+通道（L-type Ca2+channel，LTCC）迅速釋放到心肌細胞內(nèi)，當(dāng)細胞質(zhì)中的Ca2+達到了一定的濃度，RyR2通道開放，使細胞內(nèi)Ca2+超載[8]。另有研究[9,10]結(jié)果顯示烏頭堿作用于心肌細胞后的RyR2基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平上調(diào)，可使L型Ca2+通道m(xù)RNA的表達增多，使L型Ca2+通道開放數(shù)量增加而導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+增加，發(fā)生鈣超載致心律失常。付敏等[11]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用烏頭堿后，心肌細胞內(nèi)鈣振蕩的振幅明顯減小，且高濃度烏頭堿較低濃度烏頭堿致心肌細胞鈣振蕩振幅的變化更加明顯。由此可見烏頭堿對心肌細胞內(nèi)鈣信號產(chǎn)生了影響，破壞了鈣穩(wěn)態(tài)的平衡，導(dǎo)致Ca2+平衡失調(diào)，這可能是影響心肌細胞收縮-舒張功能的主要依據(jù)，從而引發(fā)心率失常。

張世忠等[12]利用心肌細胞K+通道電生理原理激動鉀通道可加強復(fù)極,抑制鈉通道激活造成的后除極化，結(jié)果表明，通過激動敏感的K+通道，顯著增高了心肌細胞對烏頭堿可耐受的最大濃度，使烏頭堿強心效果明顯增強，強心作用的有效濃度范圍顯著增高。還有研究[13,14]發(fā)現(xiàn)對心臟的毒性作用機制主要在于抑制心肌細胞質(zhì)膜Na+通道的失活，使Na+持續(xù)內(nèi)流，延長心肌細胞膜除極化時程而引發(fā)心律失常。

1.2 次烏頭堿對蛋白表達的影響

次烏頭堿也是附子中主要的雙酯型生物堿之一，對小鼠的LD50低于烏頭堿和新烏頭堿，在炮制和煎煮的過程中分解緩慢不易破壞，含量較高[15-17]，故有學(xué)者研究次烏頭堿對心肌細胞的毒性機理。易明晶[18]用蛋白印跡法和熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法（PCR），研究了附子主要有效成分次烏頭堿合甘草苷配伍前后對心肌細胞和心肌組織中鈣調(diào)控蛋白信使核苷酸（CaM mRNA）和蛋白表達的影響，次烏頭堿能夠抑制CaM的表達，和連接蛋白43（Cx43）磷酸化水平，從而影響心肌收縮功能和節(jié)律變化。

另有研究[19,20]將次烏頭堿作用于心肌細胞，觀察心肌細胞搏動頻率，結(jié)果使心肌細胞的波動頻率加快，細胞膜穩(wěn)定性破壞，當(dāng)次烏頭堿濃度超過32μmol﹒L-1時，會使心肌細胞停止搏動。用MTT法檢測次烏頭堿對心肌細胞的毒性，結(jié)果顯示次烏頭堿對心肌細胞存活率無影響。利用熒光定量PCR測細胞的蛋白表達，表明次烏頭堿灌胃給藥后能顯著抑制鈉鈣交換體（NCX） mRNA的表達細胞內(nèi)和誘導(dǎo)Ⅱ型雷諾定受體（RyR2）mRNA的表達，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，加重心律失常發(fā)生。

1.3 附子毒性與心肌細胞作用靶標(biāo)的相關(guān)性

研究中藥發(fā)揮藥效的活性成分及作用靶點一直是中藥研究的巨大挑戰(zhàn)和未來方向[21]。近年來，鈉鈣交換蛋白（NCX）成為研究心肌細胞保護，治療心律失常的新靶點，心肌舒張時，將胞漿Ca2+轉(zhuǎn)運至細胞外的最主要途徑。在病理狀態(tài)下，胞內(nèi)濃度升高，顯著影響肌漿網(wǎng)的鈣填充，誘發(fā)自發(fā)性的鈣釋放[22]。

李勇志等[22]通過觀察次烏頭堿對大鼠心肌細胞Na+通道SCN5A亞基和鈉鈣交換蛋白（NCX）mRNA表達，得出結(jié)論當(dāng)次烏頭堿濃度大于60μmol﹒L-1時，可以通過增加心肌細胞膜里Na+通道SCN5A亞基和NCX mRNA表達，進而激活L-Ca通道后參與心律失常發(fā)生過程，所以在干預(yù)這兩個靶點可以達到減毒而緩解心律失常。Li等[24]建立了高表達 VEGFR的 HEK293 細胞膜色譜[25]在線液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用篩選系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)作用于 VEGFR-2 的三個活性組分烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿，并采用體外MTT和ELISA實驗驗證了對VEGF的抑制作用。

2 附子配伍甘草對心肌細胞減毒作用機制

2.1 附子配伍甘草物質(zhì)基礎(chǔ)

甘草中含有三萜皂苷類成分甘草酸和甘草次酸，黃酮類成分甘草苷，研究表明，甘草主要有效成分甘草苷和甘草酸對心臟具有一定的保護作用，這兩類化合物的抗氧化[26]和抗炎作用[27]可能是保護心臟免受傷害的主要機制。而甘草次酸具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等廣泛活性[28]。

有關(guān)文獻報道[29]，甘草皂苷抗心律失常作用可能是其具有負性頻率和傳導(dǎo)作用，以及抗心肌缺血作用的結(jié)果。附子與炙甘草合煎后，附子烏頭堿和炙甘草黃酮類成分的量均有不同程度下降,由此推測甘草抑制附子毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與甘草黃酮有關(guān)[30]。目前認為“成分結(jié)合”學(xué)說[31]是附子-甘草配伍減毒主要作用途徑，即附子-甘草配伍合煎過程中甘草酸成分與烏頭堿等毒性成分根據(jù)酸堿成分相互作用結(jié)合而逐漸沉淀，使湯液中毒性成分雙酯型生物堿含量減少，從而使合煎液毒性降低。從藥動學(xué)角度看，甘草附子配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與其體外化學(xué)成分含量無關(guān)，而是烏頭堿與甘草次酸在體內(nèi)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，生成沉淀生成不溶于水的大分子絡(luò)合物，降低藥液中生物堿量，延緩了其在胃腸道的吸收，從而發(fā)揮解毒作用[32-35]。有研究表明[36]附子配伍甘草的比例也會影響作用效果，附子、甘草中主要有效成分次烏頭堿配伍甘草次酸對心肌細胞缺氧缺糖損傷有保護作用，其中以1:1配伍組效果最佳。甘草配伍附子對慢性心衰大鼠具有增效減毒的作用，其機制可能跟心肌細胞凋亡信號通路有關(guān)。

2.2 甘草配伍附子后對心肌細胞內(nèi)電生理的作用

周天梅[37]等運用MTT法檢測附子-甘草主要有效成分配伍后對心肌細胞存活率的影響，采用Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒測試。結(jié)果表明烏頭堿能導(dǎo)致心肌細胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和SDH活性降低，細胞存活率也下降。甘草主要有效成分配伍后，這三種酶的活性和細胞存活率具有一定程度恢復(fù)，從而保護心肌細胞損傷。其減毒機理可能是通過SDH、Na+-K+-ATP酶，Ca2+-Mg2+-ATP酶等能量代謝調(diào)節(jié)，從而抑制心肌細胞缺氧缺血，實現(xiàn)對心肌細胞損傷的保護，發(fā)揮減毒作用。

2.2 從代謝角度研究甘草配伍附子減毒機理

Hui Gong等[38]研究發(fā)現(xiàn)從甘草中分離出來的異橄欖巖，通過Nrf2激活促進解毒系統(tǒng)，這可能是甘草的潛在保護機制。孫博等[39]利用NMR代謝組學(xué)技術(shù)對附子、甘草配伍的減毒作用探究，發(fā)現(xiàn)是通過對整個代謝環(huán)境的調(diào)節(jié)，減少多種氨基酸、有機酸、酮體等代謝產(chǎn)物受附子毒性影響的含量變化幅度，來有效降低附子的毒性作用。

2.3 次烏頭堿配伍甘草次酸和甘草苷的減毒作用

劉巧云等[40]以新生SD乳鼠心肌細胞作為研究對象，觀察甘草次酸和甘草苷對次烏頭堿引起的心肌細胞形態(tài)的變化，以及對超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性的影響，結(jié)果表明480μmol﹒L-1甘草苷和120μmo﹒L-1甘草次酸能減小由120μmol﹒L-1次烏頭堿所造成的的心肌細胞形態(tài)損傷，使心肌細胞SOD和GSH-PX活力增加，降低心肌細胞的凋亡水平，同時提高其抗氧化能力，降低次烏頭堿對心肌細胞的毒性

甘草苷與次烏頭堿聯(lián)合作用于乳鼠原代心肌細胞，甘草苷與次烏頭堿協(xié)同抑制鈣調(diào)控蛋白的表達，對次烏頭堿的心肌連接蛋白43（Cx43）磷酸化的抑制作用產(chǎn)生拮抗，由此在一定程度上拮抗次烏頭堿導(dǎo)致的心律失常[18]。

王利勤[36]等研究附子有效成分次烏頭堿和甘草成分甘草次酸配伍后對H9c2心肌細胞缺糖缺氧損傷的影響，配伍后細胞形態(tài)有明顯的改善，同時降低腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（1L-1β）、肌酸激酶（CK）含量及兔抗Caspase-3、Fas-L、Fas蛋白表達，所以甘草次酸和次烏頭堿配伍后對心肌細胞缺糖缺氧損傷具有保護作用，其作用機制可能與抑制細胞凋亡和抗炎。

3 結(jié)論與討論

通過以上文獻綜述，學(xué)者們對附子配伍甘草減毒增效機理已經(jīng)取得了一定的認識，但其研究角度較單一，大多停留在藥理毒理作用或物質(zhì)基礎(chǔ)篩選階段，且研究單一組分的比較多，相互間重復(fù)性較大。將來對附子配伍甘草對大鼠心肌細胞的減毒作用機制，可以從以下幾點展開進一步研究：①大多數(shù)的研究只對烏頭堿影響大鼠心肌細胞的的離子變化引發(fā)興奮收縮耦聯(lián)機制，還未研究烏頭堿作用于心肌細胞導(dǎo)致的心率增加的抑制作用是否通過影響心肌細胞離子通道，有待于進一步研究；②研究烏頭堿類對心肌細胞受體的影響，現(xiàn)階段有學(xué)者做了對腎上腺素受體的研究，但還未對其他亞型和心肌細胞上的其他受體如M-膽堿受體有所研究。③可以研究附子甘草配伍后的物質(zhì)變化及體外轉(zhuǎn)運過程研究的還較少，也是研究的一個方向。附子配伍甘草目前僅僅針對正常心肌細胞的研究，可進一步展開對病理狀態(tài)下心肌細胞的研究。