三味龍膽花片對過敏性哮喘小鼠模型的平喘作用研究

趙學(xué)勇，高玥 ，李彥橋，方洋，蘇思雨，張靜波，古銳

過敏性哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，因暴露于過敏原導(dǎo)致間歇性氣喘，氣道高反應(yīng)性，喘息和咳嗽[1]。過敏性哮喘發(fā)病率高，在全世界范圍內(nèi)，超過3億人受到這種疾病的影響，過敏性哮喘已經(jīng)成為工業(yè)化國家和發(fā)展中國家公共衛(wèi)生服務(wù)日益增加的負(fù)擔(dān)。

對于過敏性哮喘的治療，西藥應(yīng)用的較多，但存在藥物不良反應(yīng)的難題。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在治療過敏性哮喘方面可發(fā)揮其作用。三味龍膽花片為一種上市的藏成藥，組方為白花龍膽、甘草、蜂蜜干膏。具有清熱，潤肺的功效，用于治療肺熱氣喘和咽喉炎。本研究擬通過觀察小鼠的引喘潛伏期、ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中IL-4、IFN-γ水平以及肺組織病理，以此來評價(jià)三味龍膽花片對于過敏性哮喘的治療效果,為其臨床療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6周齡雌性BALB/c小鼠，SPF級，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物公司提供，批號：SCXK（川）2015-030。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及制備

三味龍膽花片由宇妥藏藥股份有限公司提供，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20100069，批號：171002。三味龍膽花片高、中、低劑量組的給藥劑量分別為3.43 g﹒kg-1、1.71 g﹒kg-1、0.86 g﹒kg-1，即成人每日劑量的20倍、10倍、5倍。醋酸地塞米松片由國藥集團(tuán)容生制藥有限公司提供，批號：161016。醋酸地塞米松的給藥劑量為0.05 g﹒kg-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司，型號：ULUP-I；離心機(jī)，美國BECKMAN COULTER公司，型號：Allegra X-30R Centrifuge；高級多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo公司，型號：Varioska；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(jī)，常州市中威電子儀器有限公司；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)，常州郊區(qū)中威電子儀器廠；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀，常州市中威電子儀器有限公司；980型超聲霧化器，上海天緣醫(yī)用生物有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

卵清蛋白，美國SIGMA公司，批號：SLBQ9036V；氫氧化鋁凝膠佐劑，美國Thermo公司，批號：SL255649；小鼠白細(xì)胞介素4（IL-4）高敏試劑盒，聯(lián)科生物MULTI SCIENCES公司，批號：204H80442；小鼠γ干擾素（IFN-γ）試劑盒，聯(lián)科生物MULTI SCIENCES公司，批號：228080442；羧甲基纖維素鈉，成都市科龍化工試劑廠，批號：20130530；水合氯醛，成都市科龍化工試劑廠，批號：20111123；生理鹽水，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：L217071712；磷酸鹽緩沖鹽溶液，biosharp公司，批號：163061。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

6周齡雌性BALB/c小鼠60只，按照體重隨機(jī)分為空白對照組，模型組，三味龍膽花片高、中、低劑量組，地塞米松組。于激發(fā)前1h給藥，各組灌胃給藥 7 d，每日 1 次，期間自由飲食。

2.2 建立模型

參照前人方法[2～6]復(fù)制過敏性哮喘小鼠模型。2.2.1 致敏液和引喘液的制備卵清蛋白致敏液： 精密稱取卵清蛋白（OVA）0.025 g置于250 mL的容量瓶中用生理鹽水定容至刻度線。取10 mL卵清蛋白生理鹽水溶液于小燒杯中，并將5.6 mL的氫氧化鋁凝膠佐劑緩慢加入卵清蛋白生理鹽水溶液中進(jìn)行乳化，用于致敏，現(xiàn)配現(xiàn)用。

引喘液：用生理鹽水配制濃度1.5% 的卵清蛋白引喘液（即將1.5 g的卵清蛋白溶于100 mL的生理鹽水中），用于引喘，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2.2 致敏于第1、8、15天分給模型組、地塞米松組、三味龍膽花片高、中、低劑量組每只小鼠腹腔注射0.16 mL致敏液以致敏，空白對照組用等量的氫氧化鋁凝膠佐劑生理鹽水代替。

2.2.3 激發(fā) 從第19天開始，將模型組、地塞米松組、三味龍膽花片高、中、低劑量組小鼠分別置于密閉容器內(nèi)，給予1.5% OVA引喘液超聲霧化吸入以激發(fā)?？瞻讓φ战M以生理鹽水進(jìn)行霧化。每日1次，每次15 min，連續(xù)7 d。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

2.3.1 小鼠狀態(tài)觀察 觀察小鼠的精神、呼吸狀況，飲食、搔鼻抓面情況、體重變化等。

2.3.2 小鼠引喘潛伏期的觀察與測定實(shí)驗(yàn)第19、21、25天分別于霧化激發(fā)時(shí)，觀察記錄每只小鼠引喘潛伏期（即從噴入1.5%卵清蛋白液開始至小鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹肌收縮凹陷的時(shí)間），觀察記錄15分鐘,以“秒”為計(jì)算單位，共記錄3次，將3次結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果，若潛伏期超過15min，則引喘潛伏期以900秒計(jì)。

2.3.3 ELISA法檢測BALF中IL-4、IFN-γ末次激發(fā)后3 h，腹腔注射10%水合氯醛25 mL﹒kg-1使小鼠麻醉致死，頸部正中切開，暴露氣管和胸腔，結(jié)扎右肺。將靜脈留置套管針插入氣管，拔出針管并結(jié)扎氣管，連接注射器，經(jīng)注射器依次注入0.4 mL、0.3 mL、0.3 mL磷酸鹽緩沖鹽溶液，每次注入反復(fù)抽吸3次，回收支氣管肺泡灌洗液至離心管內(nèi)，經(jīng)1500 rpm、4℃離10 min，分離上清液，用于ELISA檢測。BALF上清液按 ELISA 試劑盒說明書操作，在450 nm和570 nm處測吸光度值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IL-4及IFN-γ的實(shí)際濃度。

2.3.4 肺組織病理取右側(cè)肺組織置于10%的中性甲醛溶液中，固定24 h，經(jīng)石蠟包埋、組織切片，常規(guī)脫蠟脫水，蘇木素-伊紅（HE）染色后在光鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，組間比較采用 LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般狀態(tài)

模型組小鼠經(jīng)抗原刺激后，出現(xiàn)煩躁不安，精神較差，呼吸急促，腹肌凹陷，搔鼻抓面頻繁，飲食和飲水量減少，體重減輕明顯；空白對照組小鼠呼吸均勻平穩(wěn)，無搔鼻抓面，飲食正常，體重增加；三味龍膽花片各組和地塞米松組出現(xiàn)呼吸急促、搔鼻抓面，但頻率和程度均較輕，體重輕微下降。

3.2 小鼠引喘潛伏期

與空白對照組相比，模型組小鼠引喘潛伏期明顯縮短，有極顯著差異（P＜0.01）。與模型組相比，三味龍膽花片高、中、低劑量組與地塞米松組引喘潛伏期明顯延長（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 各組小鼠引喘潛伏期比較（±s，n=10）

表1 各組小鼠引喘潛伏期比較（±s，n=10）

注：與模型組比較，**P＜0.01

組別 給藥劑量（g﹒kg-1） 引喘潛伏期（s）空白對照組 - 900.00±0.00**模型組 - 202.17±13.74地塞米松組 0.05 408.30±14.66**三味龍膽花片低劑量組 0.86 320.30±28.09**三味龍膽花片中劑量組 1.71 395.73±22.06**三味龍膽花片高劑量組 3.43 406.81±52.25**

3.3 BALF中IL-4、IFN-γ的表達(dá)情況

與空白對照組相比，模型組IL-4水平明顯升高，且具有極顯著差異（P＜0.01）。與模型組相比，三味龍膽花片低劑量組和中劑量組IL-4水平降低（P＜0.05）；地塞米松組和三味龍膽花片高劑量組IL-4水平明顯降低（P＜0.01）。

與空白對照組相比，模型組IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值降低，具有極顯著性差異（P＜0.01）。與模型組相比，地塞米松組和三味龍膽花片各劑量組IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值升高，均具有顯著性差異（P＜0.05），具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 各組小鼠BALF中 IL-4、IFN-γ的表達(dá)情況（±s，n=10）

表2 各組小鼠BALF中 IL-4、IFN-γ的表達(dá)情況（±s，n=10）

注：與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

組別 給藥劑量（g﹒kg-1）IL-4（pg﹒mL-1）IFN-γ（pg﹒mL-1） IFN-γ/IL-4空白對照組 - 17.56±5.30**496.64±24.54**30.72+8.77**模型組 - 44.76±12.92 304.48±49.85 7.63+3.30地塞米松組 0.05 28.25±8.00** 367.64±41.29* 13.71+3.05**三味龍膽花片低劑量組 0.86 33.68±8.90* 341.20±16.02* 10.70+2.20*三味龍膽花片中劑量組 1.71 32.61±4.73* 347.83±40.00* 10.77+1.22*三味龍膽花片高劑量組 3.43 30.52±4.44** 354.61±45.31* 11.89+2.28**

3.4 肺組織病理學(xué)改變

3.4.1肉眼觀察 空白對照組肺組織為淡粉紅色，表面濕潤有光澤，質(zhì)地柔軟。模型組肺組織顏色暗紅，明顯充血腫大，可見瘀斑淤點(diǎn)。各給藥組肺組織出現(xiàn)片狀紅色，輕度腫大。

3.4.2鏡下觀察 空白對照組肺臟各級支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)正常，支氣管纖毛上皮排列整齊；模型組支氣管上皮細(xì)胞增生，支氣管管腔內(nèi)可見較多的粘液分泌物，血管上皮細(xì)胞變性、脫落，肺間質(zhì)水腫，伴有炎性細(xì)胞浸潤，局部炎細(xì)胞聚集形成不規(guī)則炎性灶，細(xì)胞成分增多；地塞米松組和三味龍膽花片各劑量組支氣管管腔內(nèi)見少量炎性滲出物，支氣管上皮細(xì)胞增生，肺間質(zhì)水腫，伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤、炎細(xì)胞聚集。其中地塞米松組和高劑量組治療效果相對較好。

圖 1 各組小鼠肺組織病理圖片（HE染色 400×）

4 討論

三味龍膽花片為一種上市的藏成藥，組方為白花龍膽、甘草、蜂蜜干膏。具有清熱，潤肺的功效，用于治療肺熱氣喘和咽喉炎。方中白花龍膽為君藥，來源于大花龍膽Gentiana szechenyii Kanitz、岷縣龍膽G. purdomii Marq.、高山龍膽G. algida Pall.的花或花枝，藏名為榜間嘎保[7]?！秷D鑒》記載：白花龍膽生長在草山坡。葉小，花繁盛。味苦，功效治熱性時(shí)疫?！惰F螯》中記載：“白花龍膽性涼、味澀，治一切熱病，解毒，利喉?！?/p>

引喘潛伏期能夠評價(jià)小鼠暴露于激發(fā)環(huán)境中的癥狀表現(xiàn)。本研究觀察記錄各組小鼠的引喘潛伏期，與模型組相比，三味龍膽花片給藥各組均能顯著延長小鼠的引喘潛伏期。

有研究認(rèn)為，哮喘和炎癥與IL-4的產(chǎn)生增加和IFN-γ的產(chǎn)生減少有關(guān)[8]。過敏性哮喘為Ⅰ型過敏反應(yīng)。Ⅰ型過敏是由過敏原的特征性免疫反應(yīng)引起的，主要由Th2細(xì)胞介導(dǎo)。IFN-γ主要由Th1分泌，而Th2細(xì)胞可分泌IL-4。Th2細(xì)胞合成高水平的IL-4，導(dǎo)致過敏原特異性免疫球蛋白（Ig）E的產(chǎn)生和肥大細(xì)胞釋放介質(zhì)。Th1細(xì)胞通過分泌IFN-γ來抑制Th2免疫應(yīng)答。Th1與Th2細(xì)胞相互抑制，平衡消長，維持著動態(tài)平衡狀態(tài)。Th1細(xì)胞功能下降，一方面會誘發(fā)IFN-γ合成的不足，降低其抑制B細(xì)胞的活化和特異性IgE分泌的作用；另一方面將直接導(dǎo)致其抑制Th2細(xì)胞發(fā)育的功能減弱，誘發(fā)Th2細(xì)胞功能異常增高，導(dǎo)致IL-4、IL-5大量分泌，促進(jìn)EOS的分化和激活[9]。因此，估計(jì)Th1 / Th2細(xì)胞因子平衡關(guān)系是評估哮喘的重要工具。本研究通過考察支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ水平，以及計(jì)算IFN-γ/ IL-4比值，考察三味龍膽花片對于過敏性哮喘的治療作用。ELISA結(jié)果顯示模型組小鼠 IL-4水平升高，IFN-γ水平降低；三味龍膽花片各組均能不同程度地降低IL-4水平，同時(shí)升高IFN-γ水平，提示三味龍膽花片對過敏性哮喘的治療作用。

綜上所述，三味龍膽花片可改善小鼠霧化激發(fā)表現(xiàn)、延長小鼠引喘潛伏期、降低支氣管肺泡灌洗液中IL-4水平、升高IFN-γ水平、改善肺組織病理形態(tài)，提示三味龍膽花片對過敏性哮喘有一定的治療作用，為其臨床療效提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。