NIRS結(jié)合PLS算法快速測定西洋參飲片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的總含量Δ

左春芳，梁雪琪，喻俊峰，呂亞新，張賢良（.解放軍第50中心醫(yī)院藥劑科，河南洛陽470；.洛陽理工學(xué)院附屬中學(xué)，河南洛陽 470；.解放軍第7660部隊(duì)，河南三門峽 47400）

西洋參Panax quinquefolius又稱洋參、花旗參，為五加科植物西洋參的干燥根，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效[1-3]。西洋參藥材的主要活性物質(zhì)為人參皂苷，現(xiàn)已分離出的皂苷按其母體結(jié)構(gòu)分為4種類型：20（S）原人參二醇型、20（S）原人參三醇型、齊墩果烷型和奧克梯隆型，其中人參皂苷Rb1、Re屬于20（S）原人參二醇型，人參皂苷Rg1屬于20（S）原人參三醇型[4-6]。西洋參藥材由于受地域、環(huán)境、氣候等諸多因素的影響，品種繁多復(fù)雜，品質(zhì)良莠不齊，因此通過測定西洋參藥材中有效成分人參皂苷的含量來控制西洋參藥材的質(zhì)量是很有必要的。

2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定的西洋參飲片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量的測定方法為高效液相色譜法（HPLC），該方法雖然準(zhǔn)確度高，但飲片的前期處理非常煩瑣，測定過程耗時(shí)較長[7]。近紅外漫反射光譜技術(shù)（NIRS）是一種新興的分析技術(shù)，具有操作費(fèi)用低、樣品前處理簡單、測定速度快等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。因此，本試驗(yàn)采用NIRS結(jié)合偏最小二乘法（PLS）對西洋參飲片中的人參皂苷Rg1、Re、Rb1的總含量進(jìn)行定量測定，以達(dá)到快速檢測西洋參飲片優(yōu)劣的目的。

1 材料

1.1 儀器

Nicolet 6700型NIRS儀（美國Thermo Nicolet公司）；20A型HPLC儀，包括SPD-M20A二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）；XS105型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；RT-01型粉碎機(jī)（浙江溫嶺市大海藥材器械廠）；DK-S14型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試劑

人參皂苷Rg1對照品（批號(hào)：110703-201128，純度93.4%）、人參皂苷Re對照品（批號(hào)：110754-201324，純度：92.7%）、人參皂苷Rb1對照品（批號(hào)：110704-201223，純度：95.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 飲片

62份西洋參飲片購自洛陽不同藥店（見表1，表中未標(biāo)明國家的地區(qū)即為中國），經(jīng)解放軍第150中心醫(yī)院主任藥師梁延春鑒定為真品。

表1 西洋參飲片來源Tab 1 Resource of P.quinquefolius crude slices

2 方法與結(jié)果

2.1 人參皂苷含量（參考值）測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Intertsustain C18；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以人參皂苷Rb1峰計(jì)＞5 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，色譜見圖1。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱定待測成分各適量，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液定容，制成人參皂Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度分別為0.094、0.388、0.968 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取飲片樣品粉末適量，精密稱定，約1 g，置于錐形瓶中，加水飽和正丁醇50 mL，稱定質(zhì)量，水浴加熱回流提取1.5 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，減失的質(zhì)量用水飽和正丁醇補(bǔ)足，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，置于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶液溶解，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[8]。

2.1.4 方法學(xué)考察 按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)中人參皂Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD均＜3.0%，表明儀器精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性較好。

2.1.5 飲片樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量的測定 取62批飲片樣品各適量，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

2.2 NIRS定量校正模型建立與驗(yàn)證

2.2.1 NIRS的采集 取飲片樣品粉末（過4號(hào)篩）約5 g，置于石英樣品杯中，混合均勻，輕輕攤平，以空氣為參比，扣除背景采集NIRS。采集條件：采樣方式為積分球漫反射，分辨率為8 cm－1，采集波段為12 000～4 000 cm－1，掃描32次，溫度為（25±2）℃，相對濕度為45%～55%，重復(fù)操作3次。62份飲片樣品的近紅外原始光譜疊加圖見圖2。

2.2.2 校正集和驗(yàn)證集樣品的選擇 將表3中人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量分布情況輸入TQ Analyst 8.0分析軟件中，再隨機(jī)選取48份樣本作為校正集，14份樣本作為驗(yàn)證集，且驗(yàn)證集含量范圍處于校正集含量范圍之內(nèi)，詳見表4。

2.2.3 光譜預(yù)處理方法的選擇 以多元散射校正（MSC）、標(biāo)準(zhǔn)歸一化法（SNV）、一階導(dǎo)數(shù)法（FD）、二階導(dǎo)數(shù)法（SD）等方法預(yù)處理光譜得不同校正集相關(guān)系數(shù)（R2）、校正均方差（RMSECV），詳見表5。

表3 飲片樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量的測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 3 Results of content determination of ginsenoside Rg1，Re，Rb1in samples（n＝3，%）

圖2 62批飲片樣品的近紅外漫反射原始光譜疊加圖Fig 2 NIRS superposed spectrum of 62 batches of samples

表4 校正集與驗(yàn)證集樣品指標(biāo)成分含量分布范圍Tab 4 Distribution of target component contents of correction set and validation set

表5 不同預(yù)處理方法對定量模型性能的影響Tab 5 Effects of different pretreatment methods onthe performance of quantitative model

3 討論

運(yùn)用TQ Analyst 8.0分析軟件對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)合偏最小二乘法（PLS）建立NIRS定量模型。選擇R2、RMSECV為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)不同模型的準(zhǔn)確性與適用性。其中，RMSECV越小，代表模型的預(yù)測精度越高，R2越接近1，代表模型的預(yù)測準(zhǔn)確性越高。結(jié)果表明，以SNV+FD預(yù)處理后，人參皂苷Rg1、Re、Rb1總定量模型效果最好，可以消除多重光譜偏差，對導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行微調(diào)處理，最佳光譜預(yù)處理方法處理后得到NIRS，詳見圖3。

圖3 預(yù)處理后的近紅外漫反射光譜圖Fig 3 Pretreated NIRS spectrum

2.2.4 模型波段的選擇 分別采用SNV+FD對不同的波段進(jìn)行手動(dòng)優(yōu)化比較，通過TQ Analyst 8.0分析軟件得人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量最佳波段為7 664.23～5 236.05 cm－1，詳見表6。

表6 不同波段對R2和RMSECV的影響Tab 6 Effects of different spectral ranges on R2and RMSECV

2.2.5 主成分?jǐn)?shù)的選擇 采用內(nèi)部交叉驗(yàn)證法篩選主成分?jǐn)?shù)，選擇RMSECV值最小時(shí)對應(yīng)的主成分?jǐn)?shù)為最佳主成分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，當(dāng)人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量的RMSECV值（0.010 26）最小時(shí)，主成分?jǐn)?shù)為7，詳見圖4。

圖4 主成分?jǐn)?shù)對RMSECV的影響Fig 4 Effects of principal component fraction on RMSECV

2.2.6 定量模型的建立 運(yùn)用TQ Analyst 8.0分析軟件，以SNV+FD對光譜預(yù)處理，波段為7 664.23～5 236.05 cm－1，主成分?jǐn)?shù)為7，結(jié)合PLS法建立人參皂苷Rg1、Re、Rb1總定量模型。定量模型預(yù)測值與參考值的相關(guān)性、偏差見圖5、圖6。結(jié)果表明，校正集樣品的結(jié)果均勻地分布在回歸線的兩側(cè)，校正集的預(yù)測值與參考值結(jié)果接近，證明該模型建立成功。

圖5 定量模型預(yù)測值與參考值的相關(guān)性Fig 5 Correlation between prediction value and reference value of quantitative model

圖6 定量模型預(yù)測值與參考值的偏差Fig 6 Deviations between predicted and reference values of a quantitative model

2.2.7 定量模型的驗(yàn)證 將14批驗(yàn)證集樣品的NIRS輸入定量模型中，將測得的NIRS預(yù)測值與參考值進(jìn)行比較，結(jié)果見表7。

表7 預(yù)測值與參考值比較結(jié)果Tab 7 Compare the predicted values with the reference values

NIRS作為一種間接測定方法，首先要建立準(zhǔn)確、可靠的模型，建立該模型的前提是要收集足夠多的有代表性的樣品。本試驗(yàn)收集了62批西洋參飲片，通過驗(yàn)證該模型表明可用于所收集的西洋參飲片中人參皂苷含量的測定，但是為了進(jìn)一步提高模型的覆蓋范圍，下一步應(yīng)盡量收集更多的西洋參飲片，完善所建模型。

本試驗(yàn)僅對西洋參飲片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量建立了NIRS定量模型，為了更好地控制飲片質(zhì)量，在以后的工作中需對水分、浸出物、總灰分等檢查項(xiàng)分別建立定量模型。

建立NIRS定量模型的過程是非常煩瑣的，為了建立一個(gè)穩(wěn)定的數(shù)學(xué)模型，必須對所建模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，本試驗(yàn)以R2、RMSECV為指標(biāo)評(píng)價(jià)其精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果可信。

綜上所述，本方法快速準(zhǔn)確，簡便無污染，可用于西洋參飲片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量的快速測定。

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