5—ALA—納米金光動(dòng)力治療小鼠光老化的初步研究

葛芹 劉亞樂 李張軍

[摘要]目的：初步探討5-ALA-納米金光動(dòng)力治療小鼠皮膚光老化的作用。方法：48只雄性健康ICR小鼠分為正常對(duì)照組（8只）、光老化組（40只），正常組不予特殊處理，光老化組照射紫外線，肉眼觀察和HE染色驗(yàn)證光老化模型。40只光老化組小鼠分為B組光老化對(duì)照組，C組紅光組、D組納米金組、E組5-ALA組、F組5-ALA-納米金組，C、D、E、F組小鼠背部分別涂抹不同溶液0.5ml（分別為生理鹽水、納米金溶液、5-ALA溶液和5-ALA-納米金組溶液）避光封包3h，紅光照射10min，2周治療1次，共治療2次，A組為正常組對(duì)照組不予任何處理。觀察各組小鼠皮膚表現(xiàn)和組織病理改變。結(jié)果：與A組比較，紫外線照射后，B組小鼠皮膚皮膚增厚，出現(xiàn)皮屑、深皺紋、缺乏彈性等光老化特征；組織切片顯示，B組小鼠表皮厚度[（168.235±13.665）μm]較A組[表皮（87.165±2.627）μm]增厚（P<0.05），而膠原纖維面積密度[（7.390±2.5）%]均較A組[（40.114±3.0）%]明顯減少（P<0.05）。與B組相比，C、D、E和F組小鼠的表皮變薄[分別為（154.458±2.942）μm，（114.958±2.229）μm，（50.623±4.203）μm和（31.694±1.970）μm，P<0.05]，膠原纖維面積密度增加[分別為（15.840±3.0）%，（27.320±2.5）%，（60.812±2.0）%和（70.024±3.0）%，P<0.05]，其中以F組效果最顯著。結(jié)論：5-ALA結(jié)合體能提高光動(dòng)力療法治療小鼠光老化的療效，同時(shí)納米金的光熱作用可能用于治療光老化。

[關(guān)鍵詞]皮膚；光老化；光動(dòng)力；納米金；5-氨基乙酰丙酸；HE染色；膠原纖維；小鼠

[中圖分類號(hào)]R751 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）11-0137-04

Abstract： Objective To primarily discuss the effects of using 5-ALA- nanogold for the treatment of photoaged mice irradiated with 640nm red light. Methods 48 ICR male mice are randomly divided into normal control group （8 mice） and photoaging group （40 mice） with ultraviolet irradiation，then we verify the success of photoaging mice models utilizing HE staining and gross inspection.Second A total of 40 photoaging mice are equally devided in five groups： photoaging control group（group B） receiving no treatment， red laser group （group C），nanogolds group （group D），5-ALA group （group E）and 5-ALA-nanogold group（group F）.The dorsal skin of group C，D，E and F mice are applied 0.5ml different kinds of solutions （respectively normal saline， nanogald， 5-ALA and 5-ALA-nanogold）， then receiving red light irradiation for 10min after covering with plastic mulch for 3 hours， and received a second treatment after two weeks. The normal control group without treatment is named as group A. The dorsal skin of each group mice are analysed by clinical manifestations and histopathologic changes. Results Compared with group A， the mice skin of group B shows the photoaging charactristics such as thickened and hardened skin， loss of resilience， deep winkles and dandruffs affter irradiation from UV. HE staining show the epidermis thickness of group B[（168.235±13.665）μm] is significantly thickener than group A[（87.165±2.627）μm] （P<0.05）， and the collagen fiber area density of group B [（7.390±2.5）%] is significantly reduction than group A [（40.114±3.0）%] （P<0.05）. The epidermis thickness of group C， D， E， F are respectively thinner than group B[respectivly （154.458±2.942）μm，（114.958±2.229）μm，（50.623±4.203）μm and （31.694±1.970）μm，P<0.05] and the collagen fiber area density of group C， D， E， F are significantly on the increase [respectively （15.840±3.0）%， （27.320±2.5）%， （60.812±2.0）% and （70.024±3.0）%， P<0.05] than group B， of which the most significant effect is group F. Conclusion 5-ALA and nanogold can cooperativly effect photodynamic therapy for photoaging mice skin and the photothermal effect of nanogold may be able to treat skin photoaging.

Key words： skin； photoaging； photodynamic therapy； nanogold； 5-ALA； HE staining； collagen fibers； mice

皮膚光老化是皮膚長(zhǎng)期、反復(fù)暴露于紫外線所產(chǎn)生的皮膚早老征象[1]。許多臨床試驗(yàn)研究證實(shí)5-ALA光動(dòng)力療法能有效治療皮膚光老化[2]，其作用機(jī)制為光熱作用，但5-ALA的親水性限制其在組織和細(xì)胞膜間的通透性，影響光動(dòng)力療法的治療效果。納米金是粒徑1～100nm的金顆粒分散體系，具有生物相容性和光熱轉(zhuǎn)換作用，即在一定光照下，納米金能夠吸收光，將光能轉(zhuǎn)化為熱能，傳遞給周圍環(huán)境，使附近的物質(zhì)溫度升高[3]。研究表明納米金可和皮膚屏障相互作用使皮膚滲透性增多，提高蛋白質(zhì)類藥物的經(jīng)皮水分吸收[4]。為探索提高光動(dòng)力治療光老化療效的方法，將5-ALA-納米金結(jié)合體作為新型光敏劑[5]，經(jīng)皮給藥治療光老化小鼠進(jìn)行初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器：健康普通雄性ICR小鼠48只，質(zhì)量18～20g，清潔級(jí)（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)0014410，）。支鏈乙烯亞胺（BPEI）、5-氨基乙酰丙酸（ALA）（美國(guó)Sigma公司）。4-羥乙基哌嗪乙磺酸（C8H18N2O4S，HEPES）（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司），氯金酸（HAucl4-4H2O）（上海試劑一廠），紫外-可見分光光度計(jì)（DU-640）（日本JASCO公司），高分辨透射電子顯微鏡（JEM-200CX）、超速離心機(jī)（cp100wx）（日本HITACHI公司）、集熱式磁力攪拌器（DF-101S）（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司）、UVA燈管4支和UVB燈管2支（北京電光源研究所）、UVA和UVB型紫外線輻照計(jì)（上海希格瑪高技術(shù)有限公司）、紅光治療儀（北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckmna公司）。

1.2 納米金和5-ALA-納米金結(jié)合體的制備和檢測(cè)：采用BPEI還原法合成納米金[6-7]，利用高分辨透射電子顯微鏡拍攝納米金顆粒。ALA配制過程嚴(yán)格避光，ALA分子量為336g/mol，取0.0336g ALA加入2ml超純水，所得ALA濃度50mmol/L。4℃冷藏避光保存?zhèn)溆谩?-ALA含有氨基和羧基，在堿性條件下ALA帶負(fù)電荷。納米金顆粒表面帶正電荷，利用靜電引力可將5-ALA與納米金顆粒相結(jié)合。

1.3 小鼠皮膚光老化模型的建立：將40W的4支UVB和2支UVA并列組裝成木箱形成燈箱[8]，將小鼠置于距燈源30cm的燈箱中，實(shí)驗(yàn)前用UVA輻射計(jì)和UVB輻射計(jì)測(cè)量光強(qiáng)度。每次照光前將燈箱預(yù)熱15min，每周3次。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，第2周照射時(shí)間為20min，以后每周增加10～20min，第7周照射時(shí)間90min保持不變直至第12周。（UVA輻照強(qiáng)度累計(jì)為150.30J/cm2，UVB輻照強(qiáng)度累計(jì)為24.75J/cm2）。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組、處理和取材：將48只ICR小鼠隨機(jī)分為A組正常對(duì)照組、B組光老化對(duì)照組，C組紅光組、D組納米金組、E組5-ALA組、F組5-ALA-納米金組，每組8只。B、C、D、E、F組小鼠予以UVB和UBA照射12周。照光前3d，8%硫化鈉去除小鼠背部毛發(fā)。每次治療前2%水合氯醛（6μl/g） 腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠，C、D、E、F組小鼠每只涂抹0.5ml不同溶液（分別為生理鹽水、納米金溶液、5-ALA溶液、5-ALA-納米金結(jié)合體溶液），覆蓋無菌棉球并以不透光黑色塑料薄膜封包固定，避光3h后將小鼠背部固定于距光源10cm的處置臺(tái)上照光10min。2周后行第2次照光治療。第2次照光2周后進(jìn)行取材。

1.5 HE染色和膠原纖維染色：對(duì)各組皮膚組織行HE染色和膠原纖維染色，觀察組織改變。每組8只小鼠，每只小鼠皮膚做4張組織切片。在合適的倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，用圖像處理軟件NDP軟件測(cè)出表皮層厚度值。使用Image-Pro-Plus 6.0多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)檢測(cè)Verhoeff鐵蘇木素法染色切片，在200倍放大下隨機(jī)選取5個(gè)測(cè)定區(qū)域，按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定膠原纖維的面積密度值（目標(biāo)面積/統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，數(shù)據(jù)用（x?±s）表示，各組間差異用單因素方差分析檢驗(yàn)，并用LSD-t檢驗(yàn)作兩兩多重比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米金、5-ALA-納米金結(jié)合體的形態(tài)和特征：電鏡下制備所得的納米金顆粒粒徑大小均勻，直徑約16nm，顆粒圓潤(rùn)，表面光滑，無團(tuán)聚現(xiàn)象（見圖1）。納米金和5-ALA-納米金結(jié)合體置于紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)，在可見光波段的吸收峰在530nm左右，當(dāng)5-ALA的濃度增加到20mmol時(shí)，結(jié)合體的吸收峰出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象，吸收峰約535nm（見圖2），說明5-ALA濃度過高，影響了5-ALA-納米金結(jié)合體的穩(wěn)定性，故本實(shí)驗(yàn)所用結(jié)合體中5-ALA的濃度為10mmol[5]。

2.2 大體觀察及組織染色結(jié)果及分析

2.2.1 大體觀察結(jié)果：A組小鼠皮膚薄，彈性佳，皮紋較細(xì)膩，可見靜止性皺紋，無紅斑；B組小鼠皮膚增厚變硬，彈性差，可見粗大的皺紋，中央可見紅斑；C組和D組：小鼠皮膚厚度稍變薄，未見明顯粗大的皺紋，仍可見靜止性皺紋和紅斑；E組和F組：皮膚變薄且彈性好，未見粗大皺紋及紅斑，皮紋細(xì)膩，仍可見靜止性皺紋。大體觀察結(jié)果可知F、E兩組未見明顯差異。見圖3。

2.2.2 HE染色結(jié)果：顯微鏡下可見A組表皮較薄，真皮膠原纖維排列均勻，細(xì)長(zhǎng)且均一，真皮內(nèi)腺體分布均勻。B組表皮顆粒層及棘層增厚，真皮層厚度明顯降低，淺層血管擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維排列紊亂，真皮內(nèi)的毛囊增生，腺體排列紊亂。C組和D組表皮層厚度減少，真皮淺層膠原纖維增加，排列均一，真皮深層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見少部分粗大腫脹的膠原纖維，纖維排列紊亂。E組和F組表皮明顯變薄，真皮淺層可見新生的膠原纖維，排列與表皮平行，真皮深層仍可見部分粗大纖維，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。增生的毛囊和腺體排列趨向于整齊。見圖4。

2.2.3 膠原纖維染色結(jié)果：纖維鏡下可見A組真皮層膠原纖維排列致密緊湊，均一。B組真皮層膠原纖維粗大、腫脹，結(jié)構(gòu)稀疏紊亂，部分膠原斷裂，淺層膠原纖維明顯減少。C組和D組真皮淺層膠原纖維稍有增加，排列較均一，深層仍可見變性的膠原纖維，排列紊亂。E組真皮淺層可見明顯新生的膠原纖維，平行于表皮，真皮深層仍可見部分粗大纖維。F組真皮淺層可見大量的波浪狀，平行于表皮層均勻排列的新生膠原纖維，纖維細(xì)長(zhǎng)且均一，真皮深層可見少量的粗大的、排列紊亂的膠原纖維。見圖5。

2.2.4 小鼠皮膚表皮厚度和膠原纖維含量變化：B組小鼠皮膚表皮厚度明顯增大，膠原纖維面積密度明顯減小，與A組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；分別與D組、E組、F組相比，小鼠皮膚的表皮厚度減小，膠原纖維面積密度明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。而F組小鼠皮膚的表皮厚度、膠原纖維面積密度較E組和D組減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。與C組小鼠相比，D組表皮厚度減小，膠原纖維面積密度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

皮膚光老化的主要臨床特征有皮膚粗糙、毛細(xì)血管擴(kuò)張、色素沉著、細(xì)小和粗大皺紋、皮膚彈性降低和脆性增加[9]，組織學(xué)和電鏡下可見表皮厚度增加，真皮膠原纖維減少、排列紊亂，和大量不規(guī)則分布、扭曲分布的彈力纖維[10]。目前國(guó)內(nèi)外建造小鼠光老化模型的方法主要有照射時(shí)間與紫外線劑量?jī)煞N方法，李張軍等人利用自制裝置成功改良建立小鼠光老化模型[8]。采用相同的裝置照射ICR小鼠12周，肉眼觀察到小鼠皮膚增厚、彈性差，局部可見粗大皺紋、紅斑、鱗屑。HE染色鏡下可見表皮顆粒層及棘層增厚，真皮淺層血管擴(kuò)張、出血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維減少，異常彈性纖維增加，毛囊增生。符合小鼠光老化模型的改變，說明成功構(gòu)建了光老化小鼠模型[1]。

目前防治光老化的方法主要有涂抹防曬產(chǎn)品、口服或外用各種抗氧化藥物、激光治療和光動(dòng)力療法。與其他治療方法相比，光動(dòng)力療法（Photodynamic therapy，PDT）既能改善皮膚的光老化，也能治療和預(yù)防光損傷皮膚引起的癌前期病變和皮膚癌[11]。PDT治療光老化的機(jī)制可能有3種[12]：①選擇性剝脫作用：ALA-PDT可誘導(dǎo)光老化的成纖維細(xì)胞氧化損傷和凋亡[13]；②聯(lián)合光熱作用；③炎癥反應(yīng)：PDT治療后，機(jī)體產(chǎn)生IL-1β、TGF-β、TNF-α等炎癥因子和細(xì)胞因子產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，啟動(dòng)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制，促進(jìn)膠原生成，重塑真皮[14-15]。限制ALA-PDT療效最重要的因素之一是親水性的5-ALA阻礙其在疏水性角質(zhì)層的擴(kuò)散，為提高ALA皮膚滲透性，許多方法已被證實(shí)有效，如點(diǎn)陣激光照射使皮膚形成微孔、電離子導(dǎo)入法、應(yīng)用透皮吸收劑和將藥物改為皮內(nèi)注射等[16]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米金由于良好的化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性和獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)已被應(yīng)用于DNA檢測(cè)、腫瘤治療、藥物和基因載體等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而納米金的光熱療法治療腫瘤亦有很多報(bào)道。Riley RS等研究認(rèn)為納米金光熱作用導(dǎo)致周圍細(xì)胞DNA損傷和蛋白質(zhì)變性，血管通透性和細(xì)胞之間的納米金和其他藥物的滲透性增加，提高相應(yīng)藥物的療效[3]。Chen Z等研究顯示真皮的成纖維細(xì)胞在一定程度的熱刺激下活性增加，膠原蛋白合成增加[17]。光老化的皮膚屏障功能受損，角質(zhì)層細(xì)胞間內(nèi)聚力和機(jī)械完整性受損，表皮滲透性增加[18]，納米金透過老化的皮膚，吸收紅光后產(chǎn)生光熱作用[19]。試驗(yàn)結(jié)果表明，與紅光組和光老化組相比，納米金組的表皮變薄，膠原纖維增多（均P<0.05），推測(cè)納米金的光熱作用在一定的范圍內(nèi)可能能刺激膠原蛋白合成增加，膠原纖維增加，表皮變薄。Hadizadeh M等研究發(fā)現(xiàn)納米金與5-ALA結(jié)合協(xié)同抑制表皮類癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[20]，有研究證實(shí)納米金能增強(qiáng)光敏劑單態(tài)氧產(chǎn)率[6-7，21]和5-ALA的穩(wěn)定性[22]，同時(shí)5-ALA-納米金協(xié)同增強(qiáng)PDT抗腫瘤作用[23]。本次試驗(yàn)結(jié)果表明5-ALA-納米金結(jié)合體組較其他四組表皮厚度減小，膠原纖維增多（均P<0.05），提示納米金作為載體使5-ALA透皮吸收增多，納米金的光熱作用和5-ALA-納米金結(jié)合體增強(qiáng)光動(dòng)力嫩膚療效。本文通過5-ALA-納米金結(jié)合體的制備和對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，初步證明了5-ALA結(jié)合體能提高光動(dòng)力療法治療小鼠光老化的療效，同時(shí)納米金的光熱作用可能能治療光老化。

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[收稿日期]2018-06-15 [修回日期]2018-07-19

編輯/朱婉蓉