滇黃精不同外植體無菌體系的建立

農(nóng)艷豐 李健 吳永振

摘 要：目的：建立滇黃精外植體組織培養(yǎng)再生體系，為完善無菌快繁技術(shù)體系提供技術(shù)基礎(chǔ)。方法：以根狀莖、葉、花藥為外植體，就不同的滅菌方案、不同濃度的激素對外植體進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)。結(jié)果：根狀莖芽點(diǎn)最好的滅菌方案為75%酒精30s+0.2%HgCl2 15min的處理組合，誘導(dǎo)芽點(diǎn)生長的適宜培養(yǎng)基為6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+2，4-D 0.5mg/L；嫩葉片最佳的滅菌處理為0.1%HgCl2 13min，可控制污染率為18.7%，較好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為6-BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D3.0mg/L。75%酒精20s+0.1%HgCl2 10min滅菌處理是花藥較理想的滅菌方案，以KT1.0mg/L+2，4-D3.0mg/L為最適宜的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基。結(jié)論：試驗(yàn)中不同外植體均可完成再生體系。

關(guān)鍵詞：滇黃精；無菌體系；外植體

中圖分類號 S507 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）22-0021-04

Abstract：Polygonatum kingianum coll. et Hemsl，is one of the sources of Chinese drug，Polygonatum sibiricum. In order to establish a tissue culture regeneration system of the extract of Polygonatum kingianum coll. et Hemsl，and provide a technical basis for the establishment of a sterile rapid propagation technology system. Rhizomes，leaves and anthers were used as explants，and different sterilization schemes and different concentrations of hormones were used. The implant was subjected to an induction test. The results showed that the best sterilization scheme for rhizome buds was 75% alcohol 30s + 0.2% HgCl2 15min treatment combination. The suitable medium for inducing bud growth was 6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+2，4-D 0.5mg/L；the best sterilization treatment of young leaves was 0.1% HgCl2 13min，with the control pollution rate was 18.7%；And the preferred induction medium was 6-BA 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L+2，4-D 3.0mg/L. 75% alcohol 20s+0.1% HgCl2 10min sterilization was an ideal sterilization scheme for anthers. KT 1.0mg/L+2，4-D 3.0mg/L was the most suitable callus induction medium.In this experiment，different explants could complete the regeneration system，which can provide a scientific basis for the tissue culture and rapid propagation of Polygonatum kingianum coll. et Hemsl.

Key words：Polygonatum kingianum coll. et Hemsl；Sterile system；Explants

滇黃精（Polygonatum kingianum coll.et Hemsl），為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygo-natum）的多年生草本植物，是傳統(tǒng)的道地藥材，在我國主要分布于云南、廣西等地[1]。藥用歷史久遠(yuǎn)并且有確切的臨床療效，為《中華人民共和國藥典》2015版收錄的3種中藥黃精之一[2]。現(xiàn)代研究表明，黃精具有免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、調(diào)血脂、降血糖、抗運(yùn)動疲勞、抗腫瘤、抗動脈硬化、抗炎、抗抑郁、抗病毒、保護(hù)心血管、保護(hù)心肌細(xì)胞等保健功能[3-5]，并且含有豐富的多糖、淀粉及其他有益成分，味道甘甜，口感好，是極佳的藥食同源植物[6]。目前，市場上滇黃精以野生資源為主要來源，人工種植尚處于探索階段，急需良好的種苗來源。

國內(nèi)外在對黃精的組織培養(yǎng)技術(shù)方面的研究多集中在黃精和多花黃精上，以其根狀莖、莖段、種子、葉等器官為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)技術(shù)研究。比如，周建軍等[7]以多花黃精的種子為外植體，獲得了36%的發(fā)芽率；裴莉昕等[8]及朱伍鳳[9]發(fā)現(xiàn)黃精嫩葉可誘導(dǎo)愈傷組織，與嫩莖和根狀莖對比分析，嫩葉更容易誘導(dǎo)愈傷組織，而且葉片的褐化現(xiàn)象較少；周新華等[10]研究表明，嫩莖的萌發(fā)力明顯低于根莖芽，根莖芽相較于嫩莖更合適用作外植體材料；李鶯等[11]研究表明，黃精的根狀莖、嫩莖及葉片均能誘導(dǎo)愈傷組織，繼代增殖良好；湯盛杰等[12]研究表明，6-BA和NAA配合使用能在短時間內(nèi)增殖黃精不定芽，而且不定芽生長發(fā)育好，沒有畸形葉片產(chǎn)生；徐忠傳等[13]研究表明，培養(yǎng)基中添加6-BA時，多花黃精的不定芽重量、數(shù)量和綜合質(zhì)量等效果最好，對不定芽增加最為有利。滇黃精組織培養(yǎng)技術(shù)方面的研究報(bào)導(dǎo)僅有許麗萍等[14]以滇黃精根狀莖嫩芽為外植體，設(shè)計(jì)了不同的實(shí)驗(yàn)，萌發(fā)率并不高。

本試驗(yàn)以百色本地產(chǎn)的滇黃精作為材料，采用不同的外植體進(jìn)行滅菌誘導(dǎo)，探索滇黃精組織培養(yǎng)的無菌體系，為完善無菌快繁技術(shù)體系提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 植物材料為健壯、無病害的滇黃精帶芽根狀莖。3月份時將根狀莖種植在營養(yǎng)土中，待其成長，長出葉子并開花。葉片材料為鮮摘材料。花藥選取長度為10～20mm的未開放花蕾，在3～5℃的冰箱中處理48h。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根狀莖芽點(diǎn)滅菌及初代培養(yǎng) 將根狀莖用軟毛刷對其表面的泥土等物質(zhì)進(jìn)行刷洗，再流水沖洗根狀莖表面。從根狀莖上切取芽點(diǎn)，芽頂往下2～3cm，在超凈工作臺上使用滅菌劑進(jìn)行滅菌，將滅菌好的芽點(diǎn)接種到培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+KT（0、1.0）mg/L+NAA（0.2、0.5、3.0）mg/L+2，4-D（0.5、1.0、2.0、3.0）mg/L。10d后統(tǒng)計(jì)污染率及死亡率，30d后統(tǒng)計(jì)萌芽率，重復(fù)3次。

1.2.2 葉片滅菌及初代培養(yǎng) 剪取葉片，用小毛刷在流水下對其表面及背面刷洗，然后在超凈工作臺上進(jìn)行滅菌。將滅菌好的葉片去除葉緣后，切成5mm×5mm的小片，接種到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基設(shè)置為MS+6-BA（1.0、2.0）mg/L+NAA（1.0、2.0、3.0）mg/L，10d后統(tǒng)計(jì)污染率，30d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，重復(fù)3次。

1.2.3 花藥滅菌及初代培養(yǎng) 將處理過的滇黃精花蕾在超凈工作臺上進(jìn)行滅菌。將滅菌好的花蕾小心剔開花苞，用鑷子小心地將里面的花藥取出，接入到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基為MS+KT 3.0mg/L+2，4-D 3.0mg/L和 B5+KT 3.0mg/L，+2，4-D 3.0mg/L。10d后統(tǒng)計(jì)污染率，30d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，重復(fù)3次。

相關(guān)計(jì)算公式如下：

污染率（%）=污染外植體個數(shù)/接種外植體數(shù)×100；

死亡率（%）=死亡外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100；

萌芽率（%）=萌芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100；

誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生愈傷組織個數(shù)/接種外植體數(shù)×100

1.3 培養(yǎng)條件 pH值為5.8～6.0，光照強(qiáng)度35～46μmol·m-2·s-1，光照時間為12～14h/d，溫度為26～28℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 根狀莖芽點(diǎn)的滅菌效果和初代培養(yǎng)情況

2.1.1 根狀莖芽點(diǎn) 由表1可知，使用0.2%的HgCl2配合75%酒精滅菌，隨著0.2%HgCl2的處理時間逐漸加長，根狀莖的污染率隨之降低，滅菌效果越好，但0.2%HgCl2的處理時間超過15min后，外植體死亡率也隨之上升。各個處理之間均達(dá)到極顯著差異。綜合外植體的污染率和死亡率考慮，75%酒精30s+0.2%HgCl2 15min的處理組合，是根狀莖芽點(diǎn)較為理想的滅菌方案。

2.1.2 根狀莖芽點(diǎn) 接種的根狀莖芽點(diǎn)，在培養(yǎng)8～10d時，在原生芽眼周圍形成1～3個圓突狀萌芽點(diǎn)，萌芽點(diǎn)呈淡白綠色，直徑約1mm；20d左右，芽突長至3～5mm，并在根狀莖有傷口的區(qū)域形成一層黃白相間呈顆粒狀的愈傷組織；30d的時候，長勢較好的芽有16～22mm高，芽根部直徑3～5mm，在芽旁邊芽點(diǎn)漸漸增加，每個帶芽根狀莖上約有4～6個芽點(diǎn)。從表2數(shù)據(jù)看出，除了處理3和處理6沒有顯著差異，其他處理均達(dá)到極顯著差異。3種激素配比就能較好的誘導(dǎo)芽的生長，以6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+2，4-D 0.5mg/L為萌芽率的最高配比，萌芽率為62.9%。

2.2 葉片的滅菌效果和初代培養(yǎng)情況

2.2.1 滅菌效果 由表3可知，平均污染率除處理6、7無顯著差異，其他均達(dá)到極顯著差異；平均死亡率則處理1和處理2無差異、處理3和處理無差異，其他均有顯著差異。0.1%HgCl2溶液處理時間在18～20min時，葉片的污染率最低，為5.7%。處理時間為10min時，開始對葉片的生命力有影響，死亡率為3.1%，當(dāng)處理時間為20min時，葉片死亡率達(dá)到42.9%。綜合表3的結(jié)果可得出最佳的葉片滅菌時間為0.1%HgCl2、13min。

2.2.2 葉片的初代培養(yǎng)結(jié)果 由表4可知，處理1和處理5無顯著差異，其他處理均達(dá)到極顯著差異。本試驗(yàn)以

1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的激素來誘導(dǎo)葉片生長愈傷組織。在葉片接種9～12d，各培養(yǎng)基均開始出現(xiàn)部分葉片微向上或向下卷曲，在葉片切口周圍變淡黃色，在葉片營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸方向兩端的切口有加厚、顏色加深的現(xiàn)象。15d后，葉片開始有在切口生長愈傷組織。結(jié)果表明，不同濃度的6-BA、NAA、2，4-D溶液配合使用，對葉片愈傷組織的誘導(dǎo)有較好的效果，誘導(dǎo)率可達(dá)28%以上，最高達(dá)46.0%。

2.3 花藥的滅菌效果和初代培養(yǎng)情況

2.3.1 滅菌情況 由表5可知，處理2和處理5無顯著差異。使用75%酒精配合0.1%HgCl2溶液使用，對花藥的滅菌效果較好，相同的酒精滅菌時間前提下，污染率隨著升汞滅菌時間的加長而降低；在升汞滅菌時間相同的情況下，酒精時間的加長對滅菌效果更好。綜合表5試驗(yàn)結(jié)果對比，75%酒精滅菌20s配合0.1%HgCl2溶液10min滅菌是花藥較理想的滅菌方案。

2.3.2 初代培養(yǎng)結(jié)果 接種到培養(yǎng)基上的花藥，在接種后10d時開始形成花藥愈傷組織。開始形成前，花藥表面稍微收縮，再在花藥形態(tài)學(xué)上端出現(xiàn)淡綠色的新生點(diǎn)。在后續(xù)生長中愈傷組織4～6d生長1mm，在接種后50～60d，愈傷組織基本定型，約長到3～5mm，不再生長。由表6可知，各個處理間均達(dá)到極顯著差異，在2，4-D 3.0mg/L、KT 1.0mg/L含量時，愈傷組織的誘導(dǎo)率可達(dá)69.4%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中，根狀莖芽點(diǎn)最好的滅菌方案為75%酒精30s+0.2%HgCl2 15min的處理組合，誘導(dǎo)芽點(diǎn)生長的適宜培養(yǎng)基為6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+2，4-D 0.5mg/L。嫩葉片最佳的滅菌處理為0.1%HgCl2、13min，可控制污染率為18.7%，較好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為6-BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D 3.0mg/L。75%酒精滅菌20s配合0.1%HgCl2溶液10min滅菌則是花藥較理想的滅菌方案，KT 1.0mg/L+2，4-D3.0mg/L是最適宜的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基。

4 討論

根據(jù)資料顯示，離體植物在組培過程中，植物組織的發(fā)生和形成，與外植體的生理狀態(tài)和它的內(nèi)源激素含量有重要關(guān)系[15]，因而要提高初代培養(yǎng)時根狀莖不定芽的誘導(dǎo)率。本試驗(yàn)通過NAA、2，4-D、6-BA、KT等植物生長調(diào)節(jié)劑可以誘導(dǎo)芽點(diǎn)生長不定芽、誘導(dǎo)葉片及花藥生長愈傷組織。選擇外植體時，根狀莖宜選擇1～3年生，生長健壯，無病蟲害，多隱芽，無過多傷口和過多根系的莖段；葉片選擇剛生長的健康鮮嫩葉片；花藥選取長度為10～15mm的未開放花蕾，花蕾營養(yǎng)狀態(tài)和生理狀態(tài)都比較好，能提高花藥誘導(dǎo)的成功率。

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（責(zé)編：張宏民）