泛素羧基末端水解酶-1(UCHL1)的分子進化分析

張 瑜，孫兆貴

(1.復旦大學 上海醫(yī)學院, 上海 200032；2.國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室(上海市計劃生育科學研究所)，上海 200032)

各類蛋白參與構(gòu)成真核生物細胞結(jié)構(gòu)，其產(chǎn)生與降解都受到精確調(diào)控。在多種蛋白質(zhì)降解途徑中，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system, UPS)可降解真核細胞內(nèi)變異、錯誤折疊以及異常聚集的蛋白，該系統(tǒng)介導的蛋白降解是一種動態(tài)可逆的蛋白翻譯后調(diào)控過程，此過程由多種泛素化酶以及去泛素化酶進行精細調(diào)控。各種泛素化酶催化泛素分子與靶蛋白結(jié)合，使靶蛋白被蛋白酶體識別而降解；而去泛素化酶正好相反，它們使泛素分子與靶蛋白解離，阻止蛋白被降解。在去泛素化酶家族中有一類重要的水解酶家族——泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin C-terminal hydrolases, UCH)，它們主要是將泛素羧基末端連接的分子水解下來。目前研究較多的是泛素羧基末端水解酶1(UCHL1)。

研究發(fā)現(xiàn)UCHL1蛋白特異性高表達于腦[1]與生殖細胞[2]，與神經(jīng)退行性疾病[3]和生殖細胞的發(fā)育有關。泛素化蛋白的積聚是一系列神經(jīng)退行性疾病的普遍標志，在阿爾茨海默病患者中淀粉樣蛋白-(amyloid-beta, Aβ)蛋白積聚促進靶蛋白氧化，研究發(fā)現(xiàn)UCHL1蛋白也是氧化應激反應的一個底物，UCHL1蛋白被氧化后失去功能，導致UPS過程中的靶蛋白不能與泛素分子分離，進而導致神經(jīng)元泛素化/去泛素化機制失調(diào)，Aβ等蛋白積累，最終引起神經(jīng)元退化[4]。此外，UCHL1也參與精子發(fā)生[5]、卵母細胞的成熟[6-9]以及受精[10-12]等過程。研究發(fā)現(xiàn)25周雄性UCHL1基因缺陷型gad(-/-)小鼠生精小管萎縮，生精干細胞增殖減少[13]；雌性gad(-/-)小鼠具有多精入卵的現(xiàn)象[11-12]，本文也發(fā)現(xiàn)UCHL1敲除的小鼠成熟卵母細胞數(shù)相對野生型降低，且排卵障礙。另外，UCHL1在卵母細胞減數(shù)分裂過程中發(fā)揮一定作用：抑制UCHL1表達后，豬卵母細胞停滯在第1次減數(shù)分裂中后期過渡點，進而影響卵母細胞的正常形成[14]。這一系列現(xiàn)象都說明UCHL1缺失影響生殖細胞的正常發(fā)育。另外，UCHL1的表達與腫瘤的發(fā)生也具有一定的聯(lián)系，UCHL1蛋白在腦[15]、肺[16]、腎[17]、結(jié)腸[18]、膀胱[19]、前列腺[20]等腫瘤組織中過表達，在卵巢癌中表達量減少[21]。

迄今為止UCHL1在神經(jīng)與腫瘤方面的研究比較多，在生殖領域文獻較少，且研究對象主要集中在人、小鼠、大鼠，而對其他物種的研究較少。本文采用生物信息學手段，通過分析脊椎動物中各物種的UCHL1基因與蛋白序列，了解UCHL1基因的進化特點，預測UCHL1蛋白去泛素化功能在脊椎動物中是否普遍存在，以及其是否還具有其他功能，最終也為研究該基因參與生殖細胞發(fā)生的作用機理提供資料與新的思路。

1 數(shù)據(jù)的獲取

在NCBI的GENE庫中輸入“UCHL1”搜索得到304種生物的基因序列，點擊進入人的UCHL1基因相關信息，在“General gene information”部分可看到共有206種生物與人UCHL1基因直系同源，這些物種全部屬于脊椎動物(見表1)。挑選分別代表哺乳類、鳥類、魚類、爬行類、兩棲類這5類生物中的人(homo sapiens)、小鼠(mus musculus)、大鼠(rattus norvegicus)、馬(equus caballus)、獼猴(macaca mulatta)、雞(gallus gallus)、斑胸草雀(taeniopygia guttata)、斑馬魚(danio rerio)、綠海龜(chelonia mydas)、安樂蜥(anolis carolinensis)、非洲爪蟾(xenopus tropicalis)11個物種進行UCHL1基因分析。

表1脊椎動物中與人UCHL1直系同源的物種數(shù)

Table1ThenumberoforthologousspeciesofhumanUCHL1invertebrates

中文名英文名物種數(shù)哺乳類mammals99鳥類birds58硬骨魚類bonyfishes34蜥蜴類lizard4龜類turtles3兩棲類amphibians2鱷類crocodylia4軟骨魚類cartilaginousfishes1腔棘魚類coelacanths1

2 UCHL1基因特點分析

核酸序列分析表明UCHL1基因序列長度變化(見表2)， 除斑馬魚、雞、斑胸草雀外，其他物種的基因長度大約都在11 000 bp左右，外顯子個數(shù)基本集中在9個左右，mRNA長度基本集中在1 100 bp左右， UCHL1蛋白序列的平均長度為223 aa。這說明UCHL1在漫長的進化過程中，雖然不同生物所處的環(huán)境不同，但編碼序列比較保守，從魚類到哺乳類的變化都較小，這種進化的保守性說明這些編碼基因?qū)τ诘鞍鬃陨砉δ苁欠浅Ｖ匾模瑹o論外界環(huán)境如何變化或受到何種刺激，它們在生物進化的過程中不會輕易改變。相對于外顯子，大部分內(nèi)含子不含有功能原件，所承受的選擇壓力相對較小，其變異要遠多于外顯子。分析顯示，雞、斑胸草雀、斑馬魚的基因序列長度要遠小于其他8種生物，所以又查詢了鳥類與魚類中的幾種生物，如：鵪鶉(coturnix japonica)的UCHL1基因序列長度為4 373 bp，大山雀(parus major)為5 063 bp，家鴿(columba livia)為4 546 bp，白尾鹲(phaethon lepturus)為4 509 bp，斑鼠鳥(speckled mousebird)為4 396 bp,這些生物的基因長度大約在4 000～5 000 bp；斑點叉尾鮰(ictalurus punctatus)的UCHL1基因序列長度為4 054 bp，羊頭魚(sheepshead minnow)為4 751 bp，珍珠瑪麗魚(sailfin molly)為4 274 bp，半滑舌鰨(cynoglossus semilaevis)為3 884 bp，紅鰭東方鲀(takifugu rubripes)為3 223 bp，這些生物的基因長度約在3 000～5 000 bp，也就是大部分魚類和鳥類的UCHL1基因序列長度要比人等其他生物的短。進一步將雞、斑胸草雀、斑馬魚這3種生物的外顯子和內(nèi)含子與人類進行對比發(fā)現(xiàn)，除斑胸草雀外顯子長度變化較大外，其他3種生物外顯子長度變化非常小，而4種生物的內(nèi)含子長度變化非常大如圖1所示。這提示對內(nèi)含子進行研究可能有助于了解UCHL1對環(huán)境的適應變化。

表2 UCHL1基因特點分析Table 2 Gene characteristic analysis of UCHL1

圖1 人、斑馬魚、雞、斑胸草雀的外顯子、內(nèi)含子長度對比Fig.1 Comparison of exons and introns length in Homo sapiens, Danio rerio, Gallus gallus and Taeniopygia guttata

3 UCHL1蛋白序列同源性分析

用EMBL-EBI中的Clustal Omega程序?qū)?1種生物UCHL1基因編碼的氨基酸序列進行保守性分析如圖2所示，另外再用NCBI中的Blast程序?qū)γ績蓚€物種的氨基酸序列進行同源性對比，發(fā)現(xiàn)11個物種之間的同源性都在60%以上(未展示數(shù)據(jù)), 說明UCHL1氨基酸序列在進化上也是高度保守的。本文以人的UCHL1氨基酸序列為基礎，通過UniProt數(shù)據(jù)庫中的子數(shù)據(jù)庫UniProtKB查詢UCHL1蛋白的相關信息，人的UCHL1蛋白由223個氨基酸分子構(gòu)成，據(jù)文獻報道[22]第5～10個氨基酸區(qū)域——PMEINP(脯氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸)以及第211～216個氨基酸區(qū)域——EVRFSA(谷氨酸、纈氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、丙氨酸)是與泛素分子相互作用的部位；第90個氨基酸C(半胱氨酸)是該蛋白的親核位點；第161個氨基酸H(組氨酸)是該蛋白的質(zhì)子供體；第176位氨基酸D(天冬氨酸)對酶活性具有重要作用[23]。根據(jù)序列同源性對比，本文發(fā)現(xiàn)除了非洲爪蟾、綠海龜之外，其余9種生物都具有PMEINP區(qū)域，另外這11種生物都具有EVRFSA區(qū)域，說明這兩個區(qū)域的序列在進化上高度保守，是與泛素分子相互作用所必需的。C90、H161、D176這3個氨基酸在11種生物中也都高度保守。

除此之外，UCHL1蛋白C末端的第220位氨基酸被認為是UCHL1向膜定位的一個關鍵氨基酸。據(jù)文獻報道[24]UCHL1在神經(jīng)元中分為兩種形式：可溶性細胞質(zhì)蛋白和膜關聯(lián)蛋白，C末端發(fā)生法尼基化促進UCHL1向膜定位，使膜關聯(lián)蛋白比例增多，進而導致α-突觸核蛋白積聚，產(chǎn)生細胞毒性。但另外也有文獻[25]反對該觀點，認為C末端的法尼基化與UCHL1的膜定位無關，該文獻發(fā)現(xiàn)用法尼基化抑制劑或是使C220殘基突變都沒有降低膜關聯(lián)UCHL1蛋白的含量，反而是C末端220-223位氨基酸(CKAA)缺失導致蛋白可溶性喪失，也使UCHL1喪失與底物結(jié)合的能力，增加了神經(jīng)元細胞的死亡。盡管這兩個實驗結(jié)果仍值得進一步的重復與探討，但它們都表明C末端的氨基酸在神經(jīng)元細胞正常生存過程中發(fā)揮著重要作用。通過序列同源對比分析，除了安樂蜥與非洲爪蟾外，UCHL1蛋白序列第220位氨基酸都是半胱氨酸，這提示本文該位點在進化過程中具有高度保守性，其相關功能值得進一步分析。另外安樂蜥與非洲爪蟾第220位氨基酸是絲氨酸，該位點的突變是否會造成神經(jīng)元細胞損傷也需要進一步的研究。

圖2 UCHL1氨基酸序列保守區(qū)域分析Fig.2 Conservative region analysis of amino acid sequences

注：下劃線部分表示UCHL1發(fā)揮作用所需要的活性位點和區(qū)域；星號表示同源性較高的氨基酸。

4 UCHL1基因的分子進化樹

通過氨基酸序列同源性對比獲得這11種生物的分子進化樹如圖3所示。進化樹可分為5組：第1組包括斑馬魚(danio rerio)和非洲爪蟾(xenopus tropicalis)；第2組包括綠海龜(chelonia mydas)和安樂蜥(anolis carolinensis)；第3組包括雞(gallus gallus)和斑胸草雀(taeniopygia guttata)；第4組包括小鼠(mus musculus)、大鼠(rattus norvegicus)和馬(equus caballus)；第5組包括人(homo sapiens)、獼猴(macaca mulatta)。該分子進化趨勢與物種進化趨勢一致。

圖3 UCHL1基因系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of UCHL1

5 人類UCHL1蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

在UniProt數(shù)據(jù)庫的子數(shù)據(jù)庫UniProtKB中查詢UCHL1(Homo Sapiens)蛋白的結(jié)構(gòu)信息，在“3D structure databases”部分得到該蛋白在PDBe數(shù)據(jù)庫中的編號2ETL。UCHL1蛋白由223個氨基酸分子組成，其二級結(jié)構(gòu)包括7個α-螺旋，6個β-折疊，22個β-轉(zhuǎn)角，3個γ-轉(zhuǎn)角。其中C90位于第3個α-螺旋，H161位于第3個β-折疊，D176位于第18個β-轉(zhuǎn)角(如圖4、5所示)，這3個元素形成一個三角形的排列，并產(chǎn)生疏水性接觸。UCHL1蛋白與底物結(jié)合時，其空間構(gòu)象發(fā)生改變，氫鍵斷裂使活性位點暴露而產(chǎn)生水解酶活性，底物被釋放時又恢復無活性的狀態(tài)[26]，據(jù)文獻報道[26]UCHL1蛋白中I93M突變可能是造成帕金森綜合征的原因之一，該位點位于第3個α-螺旋的位置，也是C90所在的位置，I93M突變可能會導致C90、H161、D176三角構(gòu)型改變，進而改變活性中心結(jié)構(gòu)而影響UCHL1的功能。另外有研究推測S18Y多態(tài)性變異可抑制帕金森綜合征，這種變異提高了神經(jīng)細胞抗氧化能力，保護其免受氧化傷害[27]。S18位于第1個-螺旋，由于位于該位置的氨基酸類型在物種中比較多變，從結(jié)構(gòu)角度無法判斷S18Y多態(tài)性變異如何降低帕金森綜合征的易感性[26]。

圖4 人類UCHL1二級結(jié)構(gòu)平面圖Fig.4 Secondary structure ichnography of human UCHL1

注:圖中紅色條帶表示已知的突變，綠色條帶表示UCHL1活性位點。

圖5 人類UCHL1二級結(jié)構(gòu)立體圖Fig.5 Secondary structure graphic model of human UCHL1

注:由黑色虛線構(gòu)成的三角形為UCHL1活性區(qū)域。

6 結(jié) 論

1)通過NCBI數(shù)據(jù)庫中Gene、Protein等子數(shù)據(jù)庫分析UCHL1在不同生物中的基因與蛋白特征，發(fā)現(xiàn)UCHL1在進化中具有高度保守性，其細微差異體現(xiàn)的分子進化趨勢與物種進化趨勢完全一致。首先UCHL1基因組長度在進化過程中變化較大，外顯子個數(shù)變化較小，內(nèi)含子方面變異較大，氨基酸的個數(shù)基本維持在223個左右，這說明該蛋白具有的功能對生物自身的生存是非常重要的，即UCHL1通過其水解作用自靶蛋白解離泛素分子以維持蛋白降解平衡。其次，不同生物的UCHL1蛋白序列同源性也很高，一般在60%以上，與UCHL1功能相關的序列區(qū)域和位點在不同生物中也都高度保守。若這些位點或區(qū)域氨基酸發(fā)生突變，蛋白功能受損，將會影響生物體機能的正常運行。目前為止只有人類的UCHL1二級結(jié)構(gòu)得到了精確分析，通過上述同源性比較，預測其中的某些結(jié)構(gòu)區(qū)域在不同生物中也可能是高度保守的，比如C90、H161、D176所形成的三角疏水區(qū)域等。

2)通過上述進化分析，本文預測UCHL1的去泛素化功能在脊椎動物中是普遍存在的，可以根據(jù)UCHL1在人體中的組織特異性分布去推測其在其他生物體內(nèi)的分布，使用身體構(gòu)造更加簡單的模式動物，通過各種基因編輯方法研究該基因在某些組織中是否發(fā)揮相應的功能。例如：UCHL1發(fā)揮水解作用的位點在物種進化中存在高度保守性，可嘗試對這些位點進行點突變，或敲除相應的基因序列使其無法編碼功能氨基酸位點，或者表達一種配體蛋白與UCHL1蛋白結(jié)合使其構(gòu)象改變而不能發(fā)揮水解作用等。

3)UCHL1除了去泛素化酶作用，以二聚體形式存在時會發(fā)揮泛素連接酶的作用，但關于該作用的研究相對較少，有文獻曾經(jīng)報道[28]UCHL1以二聚體形式存在時會導致聚泛素化的-突觸核蛋白(-synuclein)的積聚，進而導致神經(jīng)元受損。根據(jù)以上進化信息，該連接酶作用可能在各種生物中普遍存在，值得進一步研究。

4)綜上所述，進化上的高度保守性表明，UCHL1雖然僅僅在大腦和生殖腺特異性高表達，但它是一種生物體發(fā)揮正常機能所必需的基因。不論是神經(jīng)疾病還是生殖疾病方面，該基因的功能得到肯定，而在作用機制研究方面卻停滯不前。另外，無論是其去泛素化酶作用還是泛素連接酶作用，還需要研究者們通過更多的實驗來探索與證實。隨著基因工程技術的突破性進展，預期對UCHL1基因的研究會有質(zhì)的突破。

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