灘涂土壤固氮菌群落與環(huán)境因子的典范對應分析①

蔡樹美，徐四新，張翰林，張德閃，呂衛(wèi)光，顧富家，諸海燾*

(1上海市農業(yè)科學院生態(tài)環(huán)境保護研究所，上海 201403；2上海市設施園藝技術重點實驗室，上海 201403；3 農業(yè)部上海農業(yè)環(huán)境與耕地保護科學觀測實驗站，上海 201403；4申農(上海)生態(tài)農業(yè)發(fā)展有限公司，上海 202150)

我國耕地資源緊缺，灘涂是重要的后備土地資源，有著巨大的開發(fā)潛力和利用價值。然而灘涂土壤并非農用耕地，惡劣的灘涂生態(tài)環(huán)境仍是制約人們更深層次利用這片資源的瓶頸。其限制因子主要包括土壤結構差、含鹽量高、有機質和全氮含量低等問題[1-3]。因此，如何合理利用和開發(fā)這片極具價值的土壤后備資源，已經成為緩解當前農業(yè)用地日益緊缺矛盾、助推農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的難點之一。

面對灘涂資源生態(tài)不斷惡化的現實，以生物利用為核心的生物改良技術近年來日趨受到重視。通過紫云英等綠肥種植和農田耕翻輪作等模式，提升土壤有機質、增加碳匯、培肥地力，已經成為近年來灘涂土壤生物改良的新趨勢。目前對灘涂紫云英-水稻輪作生物改良技術的試驗研究，大多集中在土壤類型、水分、施肥、植被等非微生物學因素方面[4-8]，對固氮菌群落結構和多樣性等微生物學因素方面的野外試驗研究相對較少。雖有報道顯示紫云英-水稻輪作能提高根際土壤和水稻根內生微生物多樣性[9-10]，但對紫云英-水稻輪作生物改良行為下灘涂土壤特殊生理類群微生物群落結構的響應機制仍不清楚，制約了灘涂土壤土地利用效率和土壤改良效率的提高。

本研究通過分析紫云英-水稻輪作模式對灘涂土壤固氮菌群落結構和土壤環(huán)境因子的影響，并通過土壤固氮菌群落結構和土壤環(huán)境因子的相關性分析，比較固氮菌群落和土壤環(huán)境對紫云英-水稻輪作模式的響應，為灘涂鹽堿地的生物改良技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2011年10月至2015年6月在上海崇明島東灘優(yōu)質水稻種植功能區(qū)進行(121o51′E，31o36′N)。該區(qū)域位于上海崇明東灘上實現代農業(yè)園區(qū)范圍內，屬北亞熱帶季風海洋性氣候，年均日照時數2 104 h，日照百分率47%，全年無霜期229 d，平均氣溫15.3 ℃，年均降水量 1 022 mm。由于園區(qū)位處新近形成的潮灘濕地，1990年才開始進行大面積圍墾，土壤普遍存在鹽堿較重、肥力偏低等問題。在前期對200份土壤樣品的調查數據中發(fā)現，pH＞7.5的土壤占比95.5%，其中pH＞8.5的堿性土壤占比24.0%；鹽分＞1 g/kg的土壤占比77.5%，部分土壤鹽分含量高達6 g/kg以上；有機質含量＜10 g/kg的土壤占比40.5%，部分土壤有機質含量低于2 g/kg。故此采取播種水稻、水稻-綠肥輪作等方式對園區(qū)土壤進行洗鹽改造。

供試水稻為當地主栽品種“花優(yōu) 14”，系上海市農業(yè)科學院選育的優(yōu)質超高產、耐鹽性強的水稻新品種，供試紫云英為余江大葉籽，供試土壤為長江泥沙淤積而成的鹽漬沙壤土。試驗區(qū)土壤地力偏低，地勢平坦。0～20 cm耕層土壤性質為：全氮0.48 g/kg，全磷0.61 g/kg，全鉀16.4 g/kg，速效氮36.3 mg/kg，有效磷22.3 mg/kg，速效鉀198.2 mg/kg，有機質4.42 g/kg，pH 8.55，全鹽 2.46 g/kg，EC 214.3 μS/cm。

1.2 試驗設計

試驗設置水稻-紫云英輪作區(qū)和水稻-冬季休閑區(qū)，每區(qū)面積66.7 m2。紫云英于每年10月5日播種，播種量為2.5 kg/667m2，于4月底全量翻壓還田。

試驗從2011年起連續(xù)進行4年，共計有4茬綠肥、4茬水稻。田間按照常規(guī)施肥方式進行水肥管理，商品有機肥用量為3 000 kg/hm2，化肥用量折算為純N 270 kg/hm2，P2O5120 kg/hm2，K2O 150 kg/hm2。氮肥分4次施用：基肥50%，蘗肥(苗期)20%，拔節(jié)肥10%，穗肥占20%；磷肥100% 作基肥；鉀肥分為基肥 50% 與拔節(jié)期追肥 50%?；势贩N選用尿素(N 46%)、復合肥(15∶15∶15)、氯化鉀(K2O 60%)。田間管理按常規(guī)方法進行。

1.3 樣品采集

選擇水稻-休閑和水稻-紫云英輪作改良 4年以上的田塊(編號分別為“1”、“2”)，分別采集土壤樣品。用土鉆采集剖面土壤樣品，采樣深度分別為0～10 cm(編號“a”)、10～20 cm(編號“b”)、20 ～40 cm(編號“c”)和 40～80 cm(編號“d”)。每個采樣點按連續(xù)“S”形采樣法均勻布10～15個點，用土鉆采集不同剖面深度土樣，將10～15個點土樣混合成1個混合樣品，每個樣地各取3個平行，共得24個混合土壤樣品。將樣品裝入已標記的自封袋中帶回實驗室，去除石塊、昆蟲殘體、植物殘根等雜質后待用。

1.4 檢測指標與方法

參照土壤農業(yè)化學分析方法，有機質采用重鉻酸鉀容量法測定；土壤樣品經H2SO4-H2O2消煮后，全氮用蒸餾定氮法測定，全磷用釩鉬黃比色法測定，全鉀用火焰光度計測定，速效氮用蒸餾定氮法測定，有效磷用鉬藍比色法測定，速效鉀用火焰光度計法測定，土壤全鹽用質量法測定，EC用電導率法測定，pH用電位法測定[11]。另取部分新鮮土樣放入已滅菌的 2 ml 離心管中，并置于-80 ℃ 冰箱保存，用PCR-DGGE法分析土壤固氮菌群落結構分析[12-13]，具體步驟如下：

1)采用Mobio Powersoil Isolation Kit試劑盒抽提土壤基因組DNA，固氮菌nifH 基因的 PCR 擴增采用 Nested-PCR 程序。

2)第一次 PCR：所用引物為固氮菌 nifH 基因的引物 FGPH 19 和 Po1R，反應體系為：BioLinker2× Taq Mix 20 μl，每種引物 1 μl，10 倍稀釋的土壤總 DNA提取液 1 μl，加 ddH2O 至反應終體積 40 μl。擴增程序為：94 ℃ 預變性 2 min；25 個循環(huán)：94 ℃變性30 s，56.4℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s；最后 72 ℃延伸 5 min。

3)第二次 PCR：反應體系與第一次相同，模板為第一次 PCR 產物，擴增程序為：94 ℃ 預變性 2 min；20 個循環(huán)：94 ℃ 變性 30 s，56.4℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s；最后一步 72 ℃延伸 5 min，獲得約 320 bp(包括 40 bp 的 GC 夾)的基因片段。

4)Reconditioning PCR：繼續(xù)進行 Reconditioning PCR以消除擴增產物中異二聚體。反應體系為：BioLinker2×Taq Mix 20 μl，每種引物 2 μl，巢氏擴增產物 4 μl，加 ddH2O 至反應終體積 40 μl。擴增程序為：94 ℃ 預變性 2 min；5 個循環(huán)：94℃ 變性 30 s，56.4℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s；最后72 ℃延伸 5 min。

5)DGGE 分析：采用 BIO-RAD DcodeTM突變檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，美國)進行固氮菌 nifH 基因的 DGGE分析。聚丙烯酰胺凝膠濃度為 8%，變性劑梯度為 53%～75%(100% 的變性劑含有 7 mol/L尿素和40%(v /v)的去離子甲酰胺，電泳緩沖液為 1×TAE buffer。60 ℃、70 V 電壓下電泳 15 h。電泳結束后，用Biolinker DNA Red染色液進行染色40 min，然后用 Bio-Rad 凝膠成像分析系統(tǒng)觀察樣品的電泳條帶并拍照。

1.5 數據處理

采用 Canoco for Windows 4.5 軟件對物種數據和相關環(huán)境因子數據進行典范對應分析(CCA)。物種數據采用固氮菌群落結構多樣性指數(香農指數Shannon-Weaver、均勻度指數Pielou Evenness和豐富度指數 Richness)，用 lg(x+1) 進行處理使之更趨于正態(tài)分布[14]。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質差異

表 1顯示了土壤環(huán)境因子在不同輪作方式下的空間變化特征。在水稻-休閑方式下，0～10 cm和10 ～20 cm土壤剖面中總氮 (TN)、NH+4-N、有機質 (SOM)含量較高，隨著剖面深度加深，TN、NH4+-N、SOM含量下降趨勢明顯。在水稻-紫云英方式下，剖面深度對 TN、NH4+-N、SOM含量的影響比水稻-休閑方式下的影響小?？傮w來看，水稻-紫云英輪作可以降低土壤電導率 (EC)，并且使灘涂土壤中0～10 cm和10～20 cm土壤剖面的pH下降。

表1 不同輪作方式下灘涂土壤理化性質Table 1 Soil physical and chemical properties under different rotation patterns

為進一步明確土壤環(huán)境因子之間的關系，對各環(huán)境因子進行典范對應分析(表2)，結果可見，土壤環(huán)境因子之間存在著相關性。TN和NH4+-N典型相關系數最高，與pH和有效磷(Olsen-P)的相關性次之；EC與、NO-3-N、Olsen-P之間的典型相關系數較高；pH與速效鉀(NH4OAc-K)的典型相關性高于其他土壤環(huán)境因子。

表2 環(huán)境因子之間的典型相關分析Table 2 Correlation coefficients between different environmental factors

2.2 土壤固氮菌PCR-DGGE分析

2.2.1 nifH基因的DGGE分析圖譜 采用Quantity one 4.6.2 對DGGE圖譜進行條帶識別及相似性分析，每條泳道不同位置的條帶為土壤樣品中被分離的 PCR產物片段，屬于不同的固氮菌類群。從圖 1可以看出，DGGE電泳圖中各泳道條帶數目、強度、遷移率均存在一定差異，兩種輪作方式下40～80 cm土壤剖面中條帶數目均較少。水稻-紫云英輪作的土壤固氮菌群落豐富度高于水稻-休閑。水稻-紫云英輪作方式下，10～20 cm土壤剖面中條帶數目最多。

2.2.2 nifH基因的多樣性指數 群落多樣性通常與物種的豐富度和均勻度密切相關。本研究采用豐富度指數Richness、香農指數Shannon-Weaver、均勻度指數Pielou Evenness對固氮菌群落多樣性進行分析。香農指數可反映群落結構的復雜程度，均勻度指數用于反映群落均勻度。從表3可以看出，水稻-紫云英輪作方式下，不同剖面深度土壤的固氮菌多樣性指數總體上高于水稻-休閑；10～20 cm土層水稻-紫云英輪作方式中土壤固氮微生物群落多樣性表現為最高，固氮菌群落組成復雜，群落多樣性高于水稻-休閑。此外，對比兩種輪作方式發(fā)現，水稻-休閑40～80 cm土層土壤固氮微生物群落的多樣性顯著低于水稻-紫云英。

2.3 固氮菌群落結構與土壤養(yǎng)分因子的關系

為進一步研究土壤固氮菌群落結構與土壤理化性質的關系，將DGGE指紋圖譜中每一條帶的光密度值作為物種數據，使用 CANOCO軟件將固氮菌群落與土壤理化性質做典范對應分析(表4)。結果顯示，固氮菌群落多樣性 CCA排序軸與環(huán)境因子相關。在前 3個排序軸中，固氮菌群落多樣性與環(huán)境的相關性分別為 0.983、0.946和 0.971，固氮菌群落多樣性與環(huán)境關系的變化累計比例分別為24.3%、41.6% 和 56.4%。前 3 個排序軸的固氮菌群落多樣性與環(huán)境關系方差累計貢獻率達到72.7%，排序結果可行有效，能較好地解釋固氮菌群落與環(huán)境之間的相關關系。

圖1 不同輪作模式下灘涂土壤nifH基因的DGGE分析圖譜Fig. 1 DGGE profiles of soil nifH genes under different rotation patterns

表3 不同輪作方式下土壤nifH基因的多樣性指數Table 3 Diversity indexes of soil microbial nifH genes under different rotation patterns

采用典范對應分析，將樣本與環(huán)境因子在同一個二維圖上反映出來，可以直觀地看出群落分布、物種分布與環(huán)境變量之間的關系。環(huán)境因子用箭頭表示，箭頭所處的象限表示環(huán)境因子與排序軸間的正負相關性，箭頭連接長度代表該環(huán)境因子與樣本分布相關程度的大小，而箭頭連線間的夾角代表環(huán)境因子間的相關性大小[15-16]。從圖2可見，第 1 象限與 NO-3-N、pH呈正相關，與 TN、 NH4+-N、NH4OAC-K、SOM呈負相關；第 2 象限與 EC、Olsen-P表現為正相關；第 3 象限與 TN、 NH4+-N、NH4OAC-K、SOM表現出正相關，與 NO-3-N、pH為負相關；第 4 象限與EC、Olsen-P為負相關。其中，SOM與NO-3-N、EC與Olsen-P之間兩兩距離較近，說明在不同固氮菌群落分布的影響下，這兩組土壤環(huán)境因子兩兩之間的變異情況較為相似。從箭頭的連線長度可以看出影響土壤固氮菌群落的重要環(huán)境因子依次為SOM、NH4+-N、Olsen-P＞TN＞pH＞NH4OAC-K＞EC＞ NO-3-N。

表 4 CCA排序圖特征值及群落多樣性與環(huán)境的典型相關分析Table 4 Eigenvalues of CCA ordination diagram and correlations between special axes and environmental axes

3 討論

固氮菌是一類植物根際促生細菌，不僅具有固氮、溶磷、解鉀等作用，還能分泌植物生長激素、抗生素類物質，促進植物生長，在維持農田生態(tài)系統(tǒng)健康穩(wěn)定、物質轉換和能量流動等方面發(fā)揮著重要作用[17-18]。作為生態(tài)系統(tǒng)中一類重要的功能菌群，固氮菌的分布特征和數量通常與土壤氮、碳循環(huán)密切相關，直接影響土壤肥力。Poly等[19-20]借助 RFLPPCR技術研究了植被覆蓋、土壤的管理制度以及土壤理化性質對nifH基因群落結構的影響，通過主成分分析發(fā)現管理制度是影響土壤nifH基因多樣性的主因，理化性質和植被覆蓋的影響次之。Bannert等[22]運用定量 PCR和T-RFLP技術研究了中國浙江慈溪地區(qū)潮灘濕地與水稻田土壤固氮菌數量和結構的多樣性差異，結果表明，土壤pH的改變使得50 a稻齡水稻田的固氮菌數量比潮灘濕地大大增加。

圖2 固氮菌多樣性與土壤環(huán)境因子的CCA二維排序圖Fig. 2 Two dimensional ordination diagram of CCA of nitrogen microbial diversity and environmental variables

盡管固氮菌在不同生境中的群落結構及其多樣性成為近年來國際上的研究熱點，但在灘涂綠肥-水稻輪作這一特殊生境中固氮菌的相關研究還未見報道，對灘涂土壤綠肥-水稻輪作改良過程中固氮菌的分布和變化特征了解甚少，對其適應和響應機制的研究尚有待深入。本研究以灘涂土壤為研究對象，分析了灘涂紫云英-水稻輪作這一特殊生境中土壤剖面理化性質、固氮菌群落結構的變化及它們之間的關系，初步探討了固氮菌群落在紫云英-水稻輪作過程中對灘涂土壤改良所起到的作用。研究結果表明，經過4年的連續(xù)紫云英-水稻輪作改良，土壤的理化性質得到了一定的提高，土壤的有機質含量增加、電導率和pH降低。受土壤理化性質改善的影響，土壤固氮菌群落也有了積極的響應，生物量及多樣性增加，能夠促進土壤氮素循環(huán)、活化土壤養(yǎng)分、提高土壤肥力和營養(yǎng)元素有效性，確保作物健康生長。因此，在固氮菌的根際促生調節(jié)功能下，通過紫云英-水稻輪作，土壤環(huán)境得到明顯的改良，而土質的改良又能穩(wěn)定固氮菌的群落結構，提高土壤-作物-微生物之間的協(xié)同互作作用。

已有對不同生態(tài)系統(tǒng)土壤中固氮菌群落結構組成的研究顯示，環(huán)境因子和種植制度對固氮菌群落結構存在影響。相關研究表明通過種植綠肥來改良灘涂，可以疏松土壤，減輕板結，增強土壤透水透氣性，減少表面土壤的積鹽，功能微生物的根際活動可以激活土壤中 CaCO3并加速其溶解，從而改善土壤理化性質并加速土壤脫鹽[23-24]。紫云英-水稻輪作由于改良措施成本低、對環(huán)境擾動小、改良效果顯著的特征而被廣泛應用于灘涂鹽堿地生態(tài)修復工程中。在本研究中，不同輪作方式對灘涂土壤環(huán)境有著不同的改良效果，對比水稻-休閑方式，水稻-紫云英輪作對10 ～20 cm土壤剖面中電導率、pH、固氮菌群落的改善作用最為顯著。兩種輪作方式下，土壤固氮菌群落結構受環(huán)境因子變化的影響有較大差異，不同土壤剖面深度的固氮菌群落結構也因受環(huán)境因子影響不同而存在差異。對土壤固氮菌群落影響較大的主要環(huán)境因子為有機質、NH4+-N和有效磷。

4 結論

1)灘涂改良過程中土壤理化性質變化規(guī)律存在著一定差異。其中，總氮和NH4+-N的相關性最高，與pH、有效磷的相關性次之；EC與NO-3-N、有效磷之間的相關性較高；pH與速效鉀的典型相關性高于其他土壤環(huán)境因子。

2)水稻-紫云英輪作的土壤固氮菌豐富度指數高于水稻-休閑，采用水稻-紫云英輪作方式更能提高灘涂土壤0～10 cm和10～20 cm剖面中固氮菌的Shannon-Weaver 多樣性指數及其均勻度。

3)典范對應分析表明，水稻-紫云英輪作方式與水稻-休閑方式下，灘涂土壤固氮菌群落結構受環(huán)境因子變化的影響有較大差異，對土壤固氮菌群落影響較大的主要環(huán)境因子為有機質、NH4+-N和有效磷。

[1] 王雨濛, 吳娟, 張安錄. 我國耕地資源問題與實現有效保護的耕地補償機制探討[J]. 農業(yè)現代化研究, 2010,31(1): 29-33

[2] 周健民. 我國耕地資源保護與地力提升[J]. 中國科學院院刊, 2013, 28(2): 263, 269-273

[3] 姚榮江, 楊勁松, 陳小兵, 等. 蘇北海涂圍墾區(qū)耕層土壤養(yǎng)分分級及其模糊綜合評價[J]. 中國土壤與肥料,2009(4): 16-20

[4] 萬建華, 徐悅, 張莉莉, 等. 濱海鹽堿土資源化利用的新探索與研究[J]. 國土與自然資源研究, 2011(5):53-55

[5] Cao W, Wong M. Current status of coastal zone issues and management in China: A review[J]. Environment International, 2007, 33(7): 985-992

[6] Wang F, Wall G. Mudflat development in Jiangsu Province,China: Practices and experiences[J]. Ocean and Coastal Management, 2010, 53(11): 691-699

[7] 金海洋. 不同農藝措施對浦東濱海灘涂墾區(qū)土壤熟化的影響[J]. 上海農業(yè)學報, 2012, 28(4): 93-96

[8] 肖克飚, 吳普特, 雷金銀, 等. 不同類型耐鹽植物對鹽堿土生物改良研究[J]. 農業(yè)環(huán)境科學學報, 2013, 31(12):2433-2440

[9] 曹艷花. 長期豆科綠肥輪作水稻根內生細菌多樣性及促生功能研究[D]. 哈爾濱: 東北農業(yè)大學, 2012: 66-69

[10] Gao S J, Zhang R G, Cao W D, et al. Long-term rice-ricegreen manure rotation changing the microbial communities in typical red paddy soil in South China[J]. Journal of Integrative Agriculture, 2015, 14(12): 2512-2520

[11] 鮑士旦. 土壤農化分析[M]. 北京: 中國農業(yè)出版社,2000: 22-24

[12] 劉驍蒨, 涂仕華, 孫錫發(fā), 等. 秸稈還田與施肥對稻田土壤微生物生物量及固氮菌群落結構的影響[J]. 生態(tài)學報, 2013, 33(17): 5210-5218

[13] 宋延靜, 張曉黎, 龔駿. 添加生物質炭對濱海鹽堿土固氮菌豐度及群落結構的影響[J]. 生態(tài)學雜志, 2014, 33(8):2168-2175

[14] 陳熙, 劉以珍, 李金前, 等. 稀土尾礦土壤細菌群落結構對植被修復的響應[J]. 生態(tài)學報, 2016, 36(13): 3943-3950

[15] 楊思存, 逄煥成, 王成寶, 等. 基于典范對應分析的甘肅引黃灌區(qū)土壤鹽漬化特征研究[J]. 中國農業(yè)科學,2014, 47(1): 100-110

[16] 趙秀芳, 楊勁松, 姚榮江. 基于典范對應分析的蘇北灘涂土壤春季鹽漬化特征研究[J]. 土壤學報, 2010, 47(3):422-428

[17] Franche C, Linderstrom K, Elmerich C. Nitrogen-fixing bacteria associated with legumes and non-leguminous plants. Plant Soil, 2009, 321: 35-59

[18] Wardle D A, Bardgett R D, Klironomos J N, et al.Ecological linkages between above ground and below ground biota[J]. Science, 2004, 304(5677): 1629-1633

[19] Poly F, Monrozier L J, Bally R. Improvement in the RFLP procedure for studying the diversity ofnifHgenes in communities of nitrogen fixers in soil[J]. Research in microbiology, 2001, 152: 95-103

[20] Poly F, Ranjard L, Nazarel S, et al. Comparison of nifH gene pools in soils and soil microenvironments with contrasting properties[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(5): 2255-2262

[21] 李剛, 王麗娟, 李玉潔, 等. 呼倫貝爾沙地不同植被恢復模式對土壤固氮微生物多樣性的影響[J]. 應用生態(tài)學報, 2013, 24(6): 1639-1646

[22] Bannert A, Kleineidam K, Wissing L, et al. Changes in diversity and functional gene abundances of microbial communities involved in nitrogen fixation, nitrification,and denitrification in a tidal wetland versus paddy soils cultivated for different time periods[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(17): 6109-6116

[23] M?rtensson L, Díez B, Wartiainen I, et al. Diazotrophic diversity, nifH gene expression and nitrogenase activity in a nice paddy field in Fujian, China[J]. Plant and Soil, 2009,325(2): 207-218

[24] Zhang X L, Li X, Zhang C, et al. Responses of soil nitrogen-fixing，ammonia-oxidizing，and denitrifying bacterial communities to long-term chlorimuron-ethyl stress in a continuously cropped soybean field in Northeast China[J]. Annals of Microbiology, 2013, 63(4):1619-1627