不同產(chǎn)地白及組培苗生理特性和顯微結(jié)構(gòu)比較研究

李 翠， 張占江， 吳慶華， 蔡錦源， 黃驍強(qiáng)，，韋 瑩， 王一諾， 韋坤華

（1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧530023 2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，中藥材生產(chǎn)工程技術(shù)中心， 南寧530023；3.廣西科技大學(xué)鹿山學(xué)院， 廣西 柳州545000）

白及（Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.）又名連及草、甘根、冰球子、利知子、連及草、紫蘭、紫蕙、百笠，為蘭科白及屬多年生草本植物，具有廣泛的藥用價(jià)值及園林價(jià)值［1］。中藥白及其塊莖主要用于補(bǔ)肺、消腫、生肌、止血、美白養(yǎng)顏，應(yīng)對(duì)手足龜裂等。有關(guān)白及的報(bào)道多集中在化學(xué)成分、藥理作用等方面［2］，白及的藥用以及景觀需求變得越來(lái)越大，而野生的白及資源在不斷減少。近年，白及開(kāi)始走組培苗工廠化生產(chǎn)路線，然而白及品質(zhì)參差不齊，且白及的生理生態(tài)特性研究缺乏，白及進(jìn)行馴化與人工栽培理論支撐不足，以致到現(xiàn)在人工栽培技術(shù)尚不成熟［3］。

探究白及體內(nèi)可溶性總糖含量的多少以及過(guò)氧化物酶活性，是作為判斷白及品質(zhì)的一項(xiàng)指標(biāo)［4］。結(jié)構(gòu)決定功能，植物葉的主要功能是光合作用和蒸騰作用，葉是綠色高等植物合成有機(jī)物的重要器官。莖是運(yùn)輸養(yǎng)分的主要器官，根是吸收水分和礦物質(zhì)的主要器官［5］。本研究旨在為篩選白及產(chǎn)業(yè)化優(yōu)質(zhì)種苗提供數(shù)據(jù)支持，通過(guò)石蠟切片法對(duì)白及組培苗解剖結(jié)構(gòu)研究，結(jié)合可溶性糖和過(guò)氧化酶等生理指標(biāo)考察，揭示白及組培苗的品質(zhì)，為其開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為生長(zhǎng)一致的武漢、合肥、重慶、杭州等4 個(gè) 不 同 產(chǎn) 地 的 白 及 （Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.）組培生根苗，選自廣西壯族自治區(qū)藥用植物園離體保存庫(kù)。

1.2 方 法

1.2.1 白及叢生芽增殖

設(shè)計(jì)9組實(shí)驗(yàn)對(duì)4個(gè)產(chǎn)地白及進(jìn)行擴(kuò)繁，篩選試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基［1］，使用的植物激素與生長(zhǎng)素為6－BA、KT和IAA，每個(gè)處理6瓶，每瓶接種5個(gè)外植體，選取的外植體大小長(zhǎng)勢(shì)接近，平鋪于培養(yǎng)基表面，60d后測(cè)試管苗平均生長(zhǎng)率。其中平均生長(zhǎng)率的計(jì)算公式為：平均生長(zhǎng)率（%）＝（30d后材料重－接種時(shí)材料重）／接種時(shí)材料重×100%。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1 500～2 000lx，光照時(shí)間12h／d，溫度（25±2）℃。

1.2.2 可溶性總糖的測(cè)定

采用蒽酮比色法，精密吸取1mL已稀釋的提取液于帶塞試管中，在冰水浴條件下加入4.0mL，酮試長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中1號(hào)管做為空白對(duì)照調(diào)零。平行做3組。并通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)樣品提取液中可溶性總糖含量。計(jì)算方法：

可溶性總糖（%）＝［（C×V×n）／（a×w×106）］×100%

式中：C 為查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得葡萄糖含量（μg）；V為提取液總體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)；a為測(cè)定體系中加入取提取液體積（mL）；w 為樣品鮮重（g）；

該實(shí)驗(yàn)中，V＝50.00mL，n＝25，a＝1.00mL

1.2.3 過(guò)氧化物歧化酶測(cè)定

過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定POD活性采用愈創(chuàng)木酚連續(xù)讀數(shù)法測(cè)定，以每分鐘D470變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U）。

玻璃比色皿中加入3mL反應(yīng)底物液和50μL 50mmol／L磷酸緩沖液（pH＝6.3）作為對(duì)照組調(diào)零。另一個(gè)玻璃比色皿中加入3mL反應(yīng)底物液和50μL酶液，迅速將比色皿放入到紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)中，立即開(kāi)啟秒表記錄時(shí)間，在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，每劑，沸水浴10min，冷卻，取3mL待測(cè)液在620nm波隔20s記錄讀數(shù)1次，記錄0～60s數(shù)據(jù)，平行做3組。

表1 正交試驗(yàn)因素水平組合

計(jì)算方法：以每分鐘OD變化值（ΔA470／（g·min）表示酶活性大小。也可以用每分鐘OD值變化0.01作為1個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位（U）表示。

過(guò)氧化物酶活性（U／（g·min））＝ΔA470×VT／W×VS×0.01×t

式中：ΔA470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)OD變化值；VT為提取酶液總體積（mL）；W 為植物鮮重（g）；Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（mL）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.2.4 根、莖、葉解剖結(jié)構(gòu)比較研究

石蠟切片法，以4個(gè)產(chǎn)地白及組培苗根、莖、葉為材料，剪取葉片中部含主脈1.0cm×0.5cm的長(zhǎng)方形，根和莖剪取0.5～1.0cm長(zhǎng)放入70%乙醇FAA固定液中固定24h。固定的材料經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水、透明劑TO透明、梯度溫度浸蠟、包埋、切片，切片厚度為10μm，番紅固綠雙重染色，并用加拿大中性樹(shù)膠封片，每個(gè)樣品重復(fù)3次，Leica DM 2000生物顯微鏡觀察，并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 不同產(chǎn)地白及組培苗擴(kuò)繁培養(yǎng)

由表2可以看出，不同產(chǎn)地的白及組培苗在不同培養(yǎng)條件下，擴(kuò)繁的平均生長(zhǎng)率有所不同。培養(yǎng)60d后，4種白及在 MS＋6－BA 2.0ml／L＋NAA 0.35ml／L＋KT 0.2ml／L培養(yǎng)的平均生長(zhǎng)率均達(dá)到最大，其中重慶產(chǎn)白及的平均生長(zhǎng)率最高，為3.32%。

2.2 可溶性糖含量

由表3可知，武漢產(chǎn)白及的可溶性總糖含量為4.71%，杭州產(chǎn)白及的可溶性總糖含量為5.87%，重慶產(chǎn)白及的可溶性總糖含量為6.11%，合肥產(chǎn)白及的可溶性總糖含量為3.17%。重慶產(chǎn)白及的可溶性總糖含量最多。白及可溶性總糖含量越高說(shuō)明白及的品質(zhì)越好。

表3 白及可溶性總糖含量

2.3 過(guò)氧化物酶活性

由表4可知，過(guò)氧化物酶活性武漢產(chǎn)白及為1.7ΔA240／（g·min），合肥產(chǎn)白及為1.33ΔA240／（g·min），杭州產(chǎn)白及為1.30ΔA240／（g·min），重慶產(chǎn)白及為1.55ΔA240／（g·min）。可見(jiàn)，武漢產(chǎn)白及的酶活性最高。

表4 過(guò)氧化物酶活性變化

2.4 白及根、莖、葉顯微結(jié)構(gòu)對(duì)比分析如下

對(duì)4個(gè)產(chǎn)地白及組培苗營(yíng)養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)比較研究表明，由圖2可看出，根、莖、葉數(shù)重慶產(chǎn)白及結(jié)構(gòu)緊密，木質(zhì)較好，材料較硬，重慶產(chǎn)白及莖，杭州產(chǎn)白及根、莖和葉片主脈發(fā)達(dá)，薄壁細(xì)胞分化完好，合肥產(chǎn)白及海綿組織發(fā)達(dá)。重慶產(chǎn)白及切片結(jié)構(gòu)最佳。

合肥產(chǎn)白及組培苗葉主脈不發(fā)達(dá)，莖細(xì)胞由大到小整齊排列，而且結(jié)構(gòu)緊密；合肥產(chǎn)白及根韌皮部較發(fā)達(dá)，保水性較好；重慶產(chǎn)白及葉主脈角質(zhì)層較厚，柵欄組織較發(fā)達(dá)，細(xì)胞排列均勻，脈間距較小，海綿組織發(fā)育較好；重慶產(chǎn)白及莖木質(zhì)纖維較硬，細(xì)胞排列緊致維管束較多；重慶產(chǎn)白及根、根毛較為發(fā)達(dá)，韌皮部與木質(zhì)部發(fā)育良好。木質(zhì)結(jié)構(gòu)好，保水性強(qiáng)；武漢產(chǎn)白及葉主脈、柵欄組織不發(fā)達(dá)，角質(zhì)層稍薄，上下表皮細(xì)胞排列均勻；武漢產(chǎn)白及莖細(xì)胞分化并不規(guī)整，而且纖維較弱維管束較少，木質(zhì)較軟；武漢產(chǎn)白及根、根毛發(fā)達(dá)，韌皮部較弱；杭州產(chǎn)白及葉主脈柵欄組織分化完整，維管束清晰，海綿組織發(fā)育較好；杭州產(chǎn)白及莖，細(xì)胞排列整齊，海綿體分化較好，但木質(zhì)纖維較少；杭州產(chǎn)白及根、韌皮部發(fā)育良好。

3 討 論

培養(yǎng)相同時(shí)間的4個(gè)產(chǎn)地白及組培苗酶活性和可溶性總糖含量差異各不相同，過(guò)氧化物酶含量差異不大，過(guò)氧化物酶是一種普遍存在于各種植物體內(nèi)的酶，其活性與植物的代謝能力、抗病和抗寒能力有著一定的聯(lián)系［6］，過(guò)氧化物酶差異不顯著說(shuō)明4個(gè)產(chǎn)地白及的抗性相近；但可溶性總糖含量差異顯著，最低的武漢產(chǎn)白及的可溶性總糖含量為3.17%，最高的重慶產(chǎn)白及的可溶性總糖含量為6.11%，可溶性糖的差異，表明4個(gè)產(chǎn)地白及體內(nèi)儲(chǔ)存的碳水化合物能力差異很大，相同時(shí)間內(nèi)，重慶產(chǎn)白及的儲(chǔ)存量最高，幾乎是武漢產(chǎn)白及的2倍，可溶性總糖是大多數(shù)植物的主要光合產(chǎn)物，并且也是碳水化合物代謝和暫時(shí)儲(chǔ)藏的主要形式，其在植物體內(nèi)還是一種重要的抗逆環(huán)境調(diào)節(jié)物質(zhì)［7－8］。

圖2 根、莖、葉橫切結(jié)構(gòu)

全球變暖背景下植物如何適應(yīng)環(huán)境是當(dāng)前生物學(xué)家所關(guān)注的重要科學(xué)問(wèn)題。葉片是植物對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)最敏感的器官之一，其表型和顯微結(jié)構(gòu)具有較大的可塑性，它們的變化能集中體現(xiàn)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性［9－10］。白及葉著生方向與地面近似垂直，葉片類型為等面葉。所以兩側(cè)受光情況差不多，葉肉中無(wú)柵欄組織和海綿組織的分化，或雖有分化，柵欄組織卻分布在葉的兩面，等面葉植物為適應(yīng)環(huán)境條件，上下表皮細(xì)胞的吸收能力相近。4個(gè)產(chǎn)地白及葉肉中無(wú)柵欄組織和海綿組織的分化，主脈發(fā)達(dá)程度差異顯著，重慶產(chǎn)白及和武漢產(chǎn)白及主脈顯著木質(zhì)化；重慶產(chǎn)白及、合肥產(chǎn)白及莖存在散生維管束，4個(gè)產(chǎn)地白及根均木質(zhì)化，從程度上來(lái)說(shuō)重慶產(chǎn)白及最顯著，武漢產(chǎn)白及最弱，可能和各地海拔有關(guān)，合肥、武漢、杭州海拔接近，都在50m以下，重慶海拔偏高，250m左右。

綜合生理指標(biāo)和根、莖、葉解剖結(jié)構(gòu)對(duì)比研究，4個(gè)產(chǎn)地白及組培苗過(guò)氧化物酶含量相近，重慶產(chǎn)白及可溶性糖含量最高，葉片主脈木質(zhì)化程度高，莖維管束較多，根系發(fā)達(dá)，木質(zhì)部和韌皮部分化細(xì)致，結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)抗性好，可以作為工廠化生產(chǎn)進(jìn)行推廣，有待深入研究。

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