荷花品種ISSR－PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

桂騰琴， 王穎娟， 伍 偉， 盧 鵬， 張萬芹

（1.興義民族師范學院生物與化學學院， 貴州 興義562400；2.貴州省民族藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室， 貴州 興義562400）

荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）為睡蓮科蓮屬植物，具有悠久的栽培歷史［1］，是中國十大傳統(tǒng)名花之一?！吨袊苫ㄆ贩N圖志》［2］按“二元分類法”原則，分別以種系、株型、花型和花色為分類標準，將荷花分為3系6群，16類48型。而在《中國荷花新品種圖志I》［3］中將荷花分為14個品種群，既保留了 “二元”分類法的框架，又符合栽培植物命名的要求。荷花全身都是寶，具有重要的觀賞和經(jīng)濟價值。

ISSR （inter－simple sequence repeat）是由 Zietkiewicz等［4］于1994年創(chuàng)建，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的特點。但是，在PCR擴增中物種不同，引物不同，ISSR－PCR 最佳反應(yīng)體系也存在很大的差別［5－8］，即使同一屬植物，引物不同，也存在很大的差別。因此，有必要對荷花品種ISSR－PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，為遺傳多樣性等的后續(xù)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于研究的荷花品種紅苔蓮采自于貴州省安龍縣十里荷花池。PCR擴增的試劑購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。單因素優(yōu)化反應(yīng)體系的引物為UBC 811（GA）8C。

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取

紅苔蓮花瓣DNA的提取采用桂騰琴等［9］的方法，提取的DNA用1% 的瓊脂糖凝膠檢測質(zhì)量，用UV－450 1S紫外分光光度計測定DNA的純度和濃度。

1.2.2 PCR擴增

初始擴增程序為：94℃5min，94℃30s，50.6℃30s，72℃90s，35次循環(huán)；72℃7min，擴增產(chǎn)物4℃保存。用1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，EB染色，在Bio－RAD凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照。

1.2.3 引物的篩選

用紅苔蓮DNA對購買的ISSR引物進行初篩，篩選多態(tài)性豐富，條帶清晰的引物進行PCR擴增，選用引物UBC 811（GA）8C為單因素的固定引物。

1.2.4 ISSR反應(yīng)體系優(yōu)化

荷花品種ISSR－PCR反應(yīng)體系各參數(shù)的設(shè)置見表1。

表1 荷花ISSR－PCR反應(yīng)體系優(yōu)化設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 Taq DNA聚合酶對ISSR擴增的影響

對PCR擴增影響很大的是Taq DNA聚合酶，濃度過低無擴增條帶，濃度過高產(chǎn)生非特異條帶，且成本過高。圖1顯示，Taq 酶濃度為0.50，0.75，1.00U 時，擴增條帶比較穩(wěn)定一致，條帶清晰，為了節(jié)約成本，選用0.75U為Taq酶的最佳濃度。

2.2 Mg2＋濃度對ISSR擴增的影響

Mg2＋濃度不僅影響PCR反應(yīng)中Taq酶活性，而且間接對PCR擴增產(chǎn)生影響［10］。試驗中設(shè)置了7個濃度（圖 2），當 Mg2＋濃度分別為 1.00，1.50，2.00 mmol／L時，擴增少帶且不穩(wěn)定。當Mg2＋濃度為2.50 mmol／L時，擴增條帶穩(wěn)定且豐富，選擇作為Mg2＋最佳濃度。

2.3 引物濃度對ISSR擴增的影響

設(shè)置7個引物濃度，圖3顯示引物濃度為0.10，0.15，0.20μmol／L和0.25μmol／L時，擴增條帶一致，但發(fā)現(xiàn)引物濃度為0.10μmol／L時，擴增條帶更亮更清晰，為了找到更合適的引物濃度，所以選了2個引物濃度0.10μmol／L和0.25μmol／L來做進一步的研究。

圖1 Taq DNA聚合酶對ISSR擴增的影響

圖2 Mg2＋濃度對ISSR擴增的影響

2.4 dNTPs濃度對ISSR擴增的影響

dNTPs濃度作為底物對PCR擴增影響很大。選擇2個引物濃度0.10μmol／L和0.25μmol／L，進一步做dNTPs濃度對ISSR－PCR擴增的影響。圖4是引物濃度為0.10μmol／L時，dNTPs 7個濃度對ISSR影響。圖5是引物濃度為0.25μmol／L時，dNTPs 7個濃度對ISSR的影響。圖4所示，引物濃度為0.10 μmol／L時，設(shè)置的7個dNTPs濃度均有擴增條帶且很亮，但條帶數(shù)少于圖5的條帶；而引物濃度為0.25 μmol／L時，擴增的條帶多且穩(wěn)定（圖5）。圖4、圖5顯示，當 dNTPs濃度為0.10mmol／L 和0.15mmol／L時，擴增條帶弱；當dNTPs濃度為0.20～0.40mmol／L時，擴增條帶比較穩(wěn)定且清晰，為了節(jié)省成本，選用dNTPs的濃度為 0.20mmol／L，引物濃度為 0.25 μmol／L作為最適濃度。

圖3 引物濃度對ISSR擴增的影響

圖4 dNTPs濃度對ISSR擴增的影響（引物濃度為0.10μmol／L）

2.5 模板DNA濃度對ISSR擴增的影響

對ISSR－PCR擴增影響很小的是模板濃度，模板濃度為10～60ng／μL時，擴增條帶穩(wěn)定一致，濃度高于80ng／μL時，擴增條帶少（圖6）。這個結(jié)果與桂騰琴［11］和 宋江華［12］的研究結(jié)果一致，因此，模板的最適濃度為10～60ng／μL。

圖5 dNTPs濃度對ISSR擴增的影響（引物濃度為0.25μmol／L）

圖6 模板濃度對ISSR擴增的影響

2.6 退火溫度對ISSR擴增的影響

不同物種同一個ISSR引物在PCR擴增中其退火溫度也不同。試驗設(shè)置了6個退火溫度：47.6，48.6，49.6，50.6，52.6，54℃，退火溫度為49.6℃，50.6℃時，擴增出清晰穩(wěn)定的條帶，當退火溫度升高到54℃時，擴增條帶明顯減少。因此，引物UBC 811的最適退火溫度為50.6℃。

2.7 體系穩(wěn)定性驗證

利用引物UBC 827在退火溫度為51.6℃ 的條件下對體系穩(wěn)定性進行檢測，圖7的擴增圖表明體系穩(wěn)定，多態(tài)性條帶豐富，為荷花品種遺傳多樣性、指紋圖譜等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

圖7 21個荷花品種的ISSR擴增圖譜（引物為UBC 827）

3 討 論

ISSR－PCR反應(yīng)雖穩(wěn)定但容易受多種因素的影響，即使同屬的植物甚至不同科屬植物反應(yīng)體系中各組分也各不相同［13，14］。ISSR 分子標記技術(shù)反應(yīng)體系中引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等相互影響，Mg2＋濃度決定Taq DNA聚合酶活性，反應(yīng)體系中一個因子濃度的改變就可能會導致擴增條帶減少，條帶位置改變等，從而影響整個實驗結(jié)果。因此，很有必要進行反應(yīng)體系的優(yōu)化。

實驗發(fā)現(xiàn)，引物濃度為0.10μmol／L時，dNTPs 7個濃度擴增的條帶雖亮，但條帶數(shù)明顯少于引物濃度為0.25μmol／L 時擴增的條帶數(shù)，說明在ISSR－PCR反應(yīng)體系中，引物濃度對PCR 擴增非常重要［15，16］。另外，對PCR擴增影響非常大的是引物的退火溫度，李立升［17］運用ISSR技術(shù)分析21個荷花品種遺傳多樣性時，引物UBC 811的退火溫度為54℃。范海艷等［18］研究博白大果油茶ISSR－PCR反應(yīng)體系時，引物UBC 811的退火溫度為52℃，實驗中引物UBC 811的退火溫度為50.6℃，說明同一個ISSR引物在不同品種擴增時其退火溫度不同，即使是同一個屬的植物采用同一個ISSR引物其退火溫度也不同［17，18］。模板濃度對PCR擴增影響最?。?9，20］，但如果模板DNA純度低，將導致無擴增條帶或少帶［18］。

通過研究最終建立了最佳反應(yīng)體系：25μL反應(yīng)體系中含2.5μL 10×buffer、0.75UTaq DNA 聚合酶、0.2mmol／L dNTPs、2.5mmol／L MgCl2、0.25 μmol／L引物、10～60ng／μL模板DNA。

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